丁酸钠对K562细胞系γ珠蛋白基因表达的诱导作用及机制

目的:研究丁酸钠对K562细胞系γ珠蛋白基因表达和胎儿血红蛋白合成的诱导作用及机制。方法:以丁酸钠(0.5 mmoL/L)诱导72h的K562细胞为实验组,设K562亲本细胞和SB203580(10μmol/L)处理1h后用丁酸钠(0.5 mmoL/L)诱导72h的K562细胞为阴性对照组,设羟基脲(100μmol/L)诱导72h的K562细胞为阳性对照。分别提取细胞总RNA和总蛋白。采用RT-PCR、Western blotting和联苯胺染色方法检测γ珠蛋白基因、胎儿血红蛋白和p38表达及p38磷酸化水平。结果:与K562亲本细胞和SB203580处理后丁酸钠诱导的K562细胞相比,丁酸钠诱导的K562细胞中G-γ珠蛋白、A-γ珠蛋白和胎儿血红蛋白的表达均明显上调(P<0.05),p38 mRNA和蛋白水平表达均无明显变化(P>0.05),但p38蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.05)。K562亲本细胞、SB203580处理后丁酸钠诱导的K562细胞和丁酸钠诱导的K562细胞中联苯胺阳性细胞百分率分别为(3.2±0.4)%、(12.7±0.2)%和(36.3±0.8)%(P<0.05)。结论:丁酸钠可以诱导K562细胞高表达γ珠蛋白基因、合成胎儿血红蛋白,p38MAPKs的激活在丁酸钠诱导K562细胞高表达γ珠蛋白基因中发挥重要作用。

低剂量羟基脲联合丁酸钠对K562细胞γ珠蛋白基因表达的作用

目的:探讨低剂量羟基脲(hydroxyurea,HU)与丁酸钠(sodium butyrate,NaB)联合诱导人白血病细胞株(K562)细胞对γ珠蛋白基因表达的作用。方法:以K562细胞株为研究对象,用不同浓度HU和/或NaB作用于K562细胞,台盼蓝拒染活细胞计数观察细胞生长;联苯胺染色了解细胞红系分化,RT-PCR测定珠蛋白基因γ-mRNA表达。结果:25μmol/L HU与100μmol/L NaB是最佳用药组合,其对细胞生长抑制率为(46.09±1.54)%,与HU100μmol/L(64.31±5.19)%、NaB 500μmol/L(86.25±1.10)%比较差异有显著性(P<0.05);联苯胺染色阳性细胞率达(17.72±0.58)%,与HU100μmol/L(15.72±0.27)%、NaB500μmol/L(14.32±0.74)%比较差异有显著性(P<0.05);与亲本细胞比较Gγ-mRNA表达上调(2.04±0.13)倍,Aγ-mRNA表达上调(1.27±0.01)倍,差异有显著性(P<0.05)。结论:低剂量HU与NaB联合用药能使K562细胞γ珠蛋白基因表达上调,并减轻细胞生长抑制,为临床联合用药提供实验依据。

γ珠蛋白基因诱导剂的研究进展

重新激活胎儿珠蛋白基因是纠正 β 珠蛋白基因缺陷性疾病异常病理生理最现实的途径。羟基脲和丁酸类化合物是目前研究最多的两种已用于治疗的诱导剂 ,显示了良好的临床疗效 ,它们的进一步推广应用 ,尚有许多问题有待解决。新的γ珠蛋白基因诱导剂还在不断被发现 。

重型β地中海贫血γ珠蛋白基因启动子区甲基化状态

本研究旨在通过对广西省重型β地中海贫血患者和正常人外周血中γ珠蛋白基因启动子区CpG岛的甲基化位点的确认和对各个CpG位点甲基化率在重型β地中海贫血患者与正常人之间的差异性分析,初步筛选出可能影响γ珠蛋白表达的主要甲基化位点。采用重亚硫酸盐测序法修饰,递降PCR扩增,最后对PCR产物进行DNA克隆测序,得到目的片段中每个CG位点的甲基化情况,定量检测甲基化的确切位置与程度。结果表明:重型β地中海贫血患者与正常人γ珠蛋白基因启动子区存在4个CpG甲基化位点,在序列中分别位于28、122、231和234bp,均呈高度甲基化,其中122和231 bp位点甲基化率明显低于正常对照组,差异均有统计学意义。28和234 bp位点甲基化率与正常对照组均无显著性差异。结论:证实γ基因启动子区存在甲基化位点、明确位点位置且经定量分析证实无论地中海贫血患者还是正常人各个甲基化位点均呈高甲基化状态;初步筛选出影响γ珠蛋白表达的主要位点可能在122和231 bp,为后续通过调节γ珠蛋白的表达缓解重型β地中海贫血的临床症状、靶向基因治疗研究提供了实验依据。

γ珠蛋白基因^(A)γ-225~-222缺失突变复合重型β-地中海贫血的临床特征分析

目的:分析γ珠蛋白基因^(A)γ-225~-222AGCA缺失突变复合重型β地中海贫血的临床特征。方法:收集2020年7月至2022年1月在广西医科大学第一附属医院门诊诊断为地中海贫血患者300例,采用血细胞分析仪进行血常规检测,高效液相色谱法(HPLC)测定胎儿血红蛋白(Hb F)和血红蛋白A_(2)(Hb A_(2));DNA测序方法分析γ珠蛋白基因突变;采用荧光PCR熔解曲线法和Gap-PCR法检测地中海贫血基因突变。结果:在300例Hb F升高的病例中,共检出16例^(A)γ-225~-222缺失突变复合重型β地中海贫血,其中7例轻度贫血,Hb为90~111.9 g/L、MCV 65.9~80.31 fL、MCH 20.22~28.06 pg;中度贫血7例,Hb60.7~87 g/L、MCV 62.9~86.24 fL、MCH 19.4~27.21 pg;重度贫血2例,其中1例Hb 47.3 g/L、MCV 77.31 f L、MCH 24.8 pg,另1例Hb 55.5 g/L、MCV 75.26 f L、MCH 24.49 pg。Hb分析16例的Hb F为8.6%~85.6%,Hb A_(2)为2.6%~9.3%。基因型分析显示,16例^(A)γ-225~-222 AGCA缺失突变。16例β地中海贫血基因突变类型为β^(CD41-42)/β^(-28)7例、β^(CD17)/β^(-28)3例、β^(-28)/β^(-28)2例、β^(IVS-I-1/β^(-28)1例、β^(CD71)-72/β^(-28)1例、β^(CD41-42)/β^(CD17)1例和βIVS-II-654)/β^(-28)1例。结论:^(A)γ-225~-222AGCA缺失突变复合重型β地中海贫血的病例大部分表现为轻度至中度贫血,该缺失突变可使重型β地中海贫血患者的贫血程度得到改善。

MicroRNA-451和microRNA-503对羟基脲诱导的K562细胞γ珠蛋白基因表达的调控作用

目的:研究羟基脲对K562细胞γ珠蛋白基因表达的影响及其中可能涉及的microRNA(miR)调控作用,以探讨药物治疗β地中海贫血的新思路。方法:用不同浓度(0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L)的羟基脲作用于K562细胞24h、48h、72h、96h,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测γ珠蛋白及相关miR基因相对表达水平。结果:K562细胞γ珠蛋白基因表达显著增高(P<0.05),miR-451a和miR-503-3p基因表达明显升高(P<0.01)。结论:羟基脲能够诱导K562细胞γ珠蛋白基因高表达,其对γ珠蛋白基因的诱导作用可能通过促进miR-451a和miR-503-3p的表达来进行调控。

沙利度胺对人红系细胞γ珠蛋白基因表达的作用及相关机制研究

目的:研究沙利度胺对人红系细胞γ珠蛋白基因表达的作用及相关调控机制。方法:采用一步液体培养法培养人红系细胞,以不同浓度沙利度胺(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L)、100 μmol/L羟基脲(阳性对照)分别作用于人红系细胞24 h、48 h、72 h、96 h,并设无任何干预的人红系细胞为空白对照组。采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测γ珠蛋白基因及转录因子BCL11A、KLF1、KLF2、GATA1基因的表达水平,Western blotting法检测γ珠蛋白的表达量。结果:作用于人红系细胞72 h后,100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L沙利度胺组γ珠蛋白基因相对表达量高于空白对照组,200 μmol/L、300 μmol/L沙利度胺组及阳性对照组γ珠蛋白表达量明显高于空白对照组(均 P <0.05);与空白对照组比较,200 μmol/L沙利度胺组BCL11A、KLF1基因表达明显下降,阳性对照组BCL11A基因表达下降,KLF2基因表达升高( P <0.05)。结论:沙利度胺能诱导体外人红系细胞γ珠蛋白基因表达,增加γ珠蛋白的生成,BCL11A、KLF1的下调可能是沙利度胺诱导γ珠蛋白基因表达的作用机制之一。

β地中海贫血杂合子基因突变及Gγ珠蛋白基因-158位点SNP与HbF的关系

目的 探讨 β地中海贫血 (简称 β地贫 )杂合子基因突变类型和 Gγ珠蛋白基因启动子 - 15 8位点 (Gγ- 15 8)单核苷酸多态性与胎儿血红蛋白 (fetal hemoglobin,Hb F)水平的关系。方法 抗碱 -比色法测定 Hb F水平 ;PCR-寡核苷酸斑点杂交法检测β地贫基因型 ;限制性内切酶 Xmn 消化经 PCR扩增的Gγ基因启动子 DNA片段 ,分析Gγ- 15 8位点的单核苷酸多态性。结果 6 3例受检的轻型β地贫中 15例 Hb F≥ 2 % (2 .0 6 %～ 10 .4 4 % )。共检出 6种β地贫基因突变 ,分别是 :CD4 1/42 (- TTCT)、CD17(A→T)、nt- 2 8(A→ G)、CD71/72 (+A)、IVS- II- 6 5 4 (C→ T)、IVS- I- 1(G→ T)。 CD4 1/42、CD17、CD71/72、IVS- II-6 5 4的杂合子在 15例 Hb F升高组和 4 8例 Hb F正常组各自所占比例相同。 6 3例个体中有 10例为Gγ-15 8(C→T)突变的杂合子 ,总检出率为 15 .9% ;其中 15例高 Hb F个体中检出 8例 (检出率 5 3.33% ) ,HbF正常的 4 8例检出 2例 (检出率 4 .17% ) ,两组检出率差异有显著性 (P<0 .0 0 1)。结论 β地贫基因突变CD4 1/42、CD17、CD71/72、IVS- II- 6 5 4与 β地贫杂合子的 Hb F水平无关 ;而 Gγ- 15 8(C→ T)突变与广西地区 β地贫杂合子 Hb F升高密切相关。

黄芪多糖诱导K562细胞γ-珠蛋白基因表达

目的探讨黄芪多糖(APS)对K562细胞γ-珠蛋白基因表达的诱导作用。方法以K562细胞为模型,以APS诱导的细胞为实验组,未加药细胞为空白对照,丁酸钠(NaB)处理的细胞为阳性对照,分别用联苯胺染色和RT-PCR分析联苯胺染色阳性率、Aγ-和Gγ-珠蛋白基因mRNA表达水平。结果(1)与空白对照组相比,300mg/LAPS诱导48h后联苯胺染色阳性率由(4.37±0.58)%升高至(15.67±1.80)%(P<0.05)。300mg/LAPS诱导K562细胞48h的联苯胺染色阳性细胞总数为(60.40±6.33)×102,与NaB组(42.02±16.42)×102相比差异有显著性意义(P<0.05)。(2)与空白对照组相比,300mg/LAPS诱导48hAγ和Gγ珠蛋白基因mRNA表达分别增加3.59±0.16倍和5.02±0.81倍(P=0.000)。结论APS可诱导K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA表达增强,具有治疗β-珠蛋白生成障碍性贫血的潜能。

西罗莫司诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达机制探讨

目的探讨西罗莫司诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的作用机制。方法终浓度10 nmol·L-1西罗莫司处理K562细胞3 d,同时设立阳性药物(丁酸钠)对照、二甲基亚砜对照和空白对照。采用Western blot方法检测p38MAPK。采用基于Real time PCR的染色质免疫共沉淀方法分析γ珠蛋白基因启动子乙酰化组蛋白H3水平。结果经西罗莫司处理的K562细胞的磷酸化p38MAPK相对水平及γ珠蛋白基因启动子乙酰化组蛋白H3水平分别比空白对照细胞升高2.8和9.8倍、分别比二甲基亚砜处理组升高2.9和9.1倍,而与丁酸钠处理的细胞无显著性差别。SB203580预处理K562细胞可中止西罗莫司升高磷酸化p38MAPK及γ珠蛋白基因启动子乙酰化组蛋白H3的作用。结论西罗莫司诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的机制与其激活p38MAPK信号和上调启动子乙酰化组蛋白H3有关。

苦参碱上调K562细胞γ珠蛋白mRNA表达和诱导红系分化

目的研究苦参碱对K562细胞γ珠蛋白mRNA表达及红系分化作用。方法不同水平苦参碱诱导K562细胞6d,应用台盼蓝拒染试验细胞计数、联苯胺染色、Wright-Gimesa染色进行红系分化的研究,同时应用荧光定量RT-PCR技术来相对定量研究药物诱导后Gγ、Aγ珠蛋白基因mRNA表达水平的变化。结果K562细胞增殖抑制程度随苦参碱水平增大而增加,联苯胺染色阳性细胞数由未诱导时的0.7%最高可上升至15.7%,且在形态上出现向红系分化的特征,同时伴有Gγ珠蛋白mRNA表达增加。结论苦参碱可引起K562细胞增殖抑制,在诱导其向红系方向分化中伴有Gγ珠蛋白mRNA表达被上调,为药物诱导治疗β珠蛋白基因缺陷性疾病提供实验依据。

补气益精生血中药对人红系细胞组蛋白修饰酶的影响

目的 观察补气益精生血中药对人红系K562细胞株组蛋白修饰酶的影响。方法 运用补气益精生血、补气生血、益精生血的中药分别以高、低浓度对K562细胞株进行诱导,并以丁酸钠作阳性对照。以实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测细胞γ珠蛋白基因基因mRNA水平,采用酶标仪以比色法检测细胞组蛋白脱乙酰基酶(HDAC1、HDAC2),组蛋白乙酰基转移酶(HAT)酶活性水平,PCR方法检测HDAC1、HDAC2、HAT基因mRNA水平,Western Blot方法检测HDAC1、HDAC2、HAT蛋白水平。结果 补气益精高剂量组、补气高剂量组、益精低剂量组中药及丁酸钠均显著提升了γ珠蛋白基因表达水平。补气益精高、低剂量组及益精高、低剂量组的细胞HAT酶活性水平均显著高于空白对照组,而丁酸钠组的HDAC1酶活性水平则显著低于空白对照组。对于HAT基因的mRNA水平,补气益精高、低剂量组,益精高剂量组显著高于空白对照组。Western Blot结果则只有补气益精高剂量组和益精高剂量组的HAT蛋白水平显著高于空白对照组。结论 补气益精生血中药可能通过上调HAT基因的表达进而促进红系细胞内γ珠蛋白基因启动子区组蛋白的乙酰化修饰,其诱导γ珠蛋白基因表达治疗儿童β地中海贫血的分子机制可能与调节组蛋白修饰酶有关。

足月儿与早产儿脐血有核红细胞基因组DNA甲基化差异分析

目的:采用甲基化基因芯片技术从全基因组水平分析足月儿与早产儿脐血有核红细胞DAN甲基化差异,筛选出可能与γ珠蛋白基因(HBG)表达相关的差异甲基化基因及生物信号通路。方法:收集足月产儿及早产儿各8例,取其脐血标本,分离脐血有核红细胞并提取基因组DNA,并对其进行亚硫酸氢盐转化。利用Illumina 850K甲基化芯片检测2组样本的DNA甲基化位点。筛选差异甲基化位点,并通过GO和KEGG富集分析得到差异甲基化基因的功能。结果:相较于早产组,足月组共筛选到4749个差异甲基化位点,其中低甲基化位点4359个,高甲基化位点390个。GO和KEGG分析结果显示,差异甲基化基因的功能主要涉及造血系统、生长发育过程、Wnt和Notch信号通路等。结论:本研究获得了足月组和早产组脐血有核红细胞在全基因组水平的差异甲基化位点,筛选出可能与γ→β珠蛋白基因表达转换相关的通路和基因。这为后续进一步研究HBG基因的表达调控机制提供了新的研究靶点。

补肾益髓法对地中海贫血患者β-珠蛋白及BCL11A基因表达的影响

目的:探讨补肾益髓法对地中海贫血患者β-珠蛋白基因的调控作用及B细胞淋巴瘤11A蛋白(B-cell lymphoma11A,BCL 11A)基因表达影响。方法:将82例患者随机分为对照组和治疗组,每组41例。对照组口服羟基脲片治疗,每日25 mg·kg^(-1),每周2次,6周为1个疗程,连续治疗2个疗程。治疗组:在对照组的治疗基础上,配合应用补肾益髓法治疗,方药组成:山萸肉、何首乌、熟地黄、补骨脂、黄芪、鳖甲、甘草。各每袋10 g,生药量相当于2.27 g中药原材,由中国中医科学院广安门医院大兴制剂中心生产,每日1袋,每日3次,温开水冲服,连续治疗3个月。观察两组患者治疗前后血常规、β珠蛋白基因mRNA(β-mRNA)、γ珠蛋白基因mRNA(γ-mRNA)、BCL 11A水平变化情况,并比较两组患者的临床疗效。结果:与治疗前比较,两组患者血红蛋白(hemoglobin,Hb)、红细胞总数(red blood cel,RBC)、网织红细胞(reticulocyte,Ret)、红细胞平均体积(erythrocyte mean corpuscular,MCV)、γ-mRNA及γ/(γ+β)mRNA水平均较治疗前明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);BCL 11A及中医证候评分均较治疗前明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,治疗组患者治疗后Hb、RBC、Ret、MCV、γmRNA、γ/(γ+β)mRNA表达水平改善情况及治疗有效率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);BCL 11A水平及中医证候评分均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),两组之间及治疗前后β-mRNA水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);两组不良反应比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:补肾益髓法能有效降低地中海贫血患者BCL 11A表达水平,提高Hb、WBC、Ret和γ-mRNA表达水平,具有较好的临床疗效,安全性良好,但对β-mRNA水平无明显影响,其具体作用机制有待于进一步研究。

~Aγ-225～-222缺失复合β地中海贫血的研究

目的:探讨Aγ-225^-222缺失导致的非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(nondeletional hereditary persistence of fetal hemoglobin,nd-HPFH)复合β地中海贫血的基因突变和临床特征。方法:选择2013年6月至2014年7月在广西医科大学第一附属医院就诊的病例进行血常规检查;应用高效液相色谱法(HPLC)测定血红蛋白Hb F和Hb A2水平;应用DNA测序方法分析γ珠蛋白基因突变;应用反向斑点杂交(RDB)和gap-PCR方法检测地中海贫血基因突变;应用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计分析。结果:在122例Hb F增高的病例中,检测出7例Aγ-225^-222AGCA缺失杂合子,其中3例复合Gγ-158C→T突变杂合子,1例同时复合β地中海贫血-28A→G突变杂合子以及Gγ-158C→T突变杂合子,1例复合β地中海贫血CD17A→T突变杂合子。血常规检查显示7例Hb为96.7~142.3g/L,MCV为54.61~77.65fl,MCH为16.10~25.26pg。Hb分析显示7例Hb F为4.0%~11.2%,其中复合Gγ-158C→T突变杂合子Hb F为4.0%~8.1%,复合β地中海贫血杂合子Hb F为8.1%~11.2%。5例Hb A2正常,2例复合β地中海贫血杂合子Hb A2增高(5.6%~6.4%)。Aγ-225^-222缺失复合β地中海贫血杂合子与β地中海贫血杂合子相比,Hb F、Hb水平明显升高(P<0.05)。结论:Aγ-225^-222缺失可导致Hb F水平升高,其杂合子均无临床症状,Hb正常或降低,MCV、MCH降低。Aγ-225^-222缺失复合β地中海贫血杂合子的Hb F、Hb水平明显高于β地中海贫血杂合子。

MicroRNA210和microRNA486与红系造血调控的研究进展

微小RNA（micro RNA）是一组约22个核苷酸长度的单链小分子非编码RNA,通过与蛋白结合形成沉默复合物,抑制转录和m RNA降解,参与多种生物学过程。目前已有大量文献报道micro RNA参与红系调控,如micro RNA376a的高表达可负向调控红系的分化与成熟,micro RNA146b、micro RNA451、micro RNA144/451、micro191等则在红系分化、成熟过程中通过不同途径对红系分化、成熟起着正向调节作用。

黄芪多糖对K562细胞胎儿血红蛋白合成和细胞增殖的影响

目的探讨黄芪多糖(APS)对K562细胞胎儿血红蛋白(HbF)合成和细胞增殖的影响。方法以K562细胞为模型,不同质量浓度APS(150、300、450 mg/L)诱导的细胞为实验组,丁酸钠(NaB)诱导的细胞为阳性对照,分别用Western blot和锥虫蓝拒染法计数分析HbF表达水平和对K562细胞增殖的影响。结果1.剂量效应:150、300和450 mg/L APS分别诱导K562细胞48 h,HbF合成增强(F=310.476 P=0),分别增加至未加药组的(1.56±0.03)、(1.78±0.04)和(1.51±0.32)倍,诱导前后有显著性差异。300 mg/LAPS组诱导时HbF合成最强(P=0.005)。2.时间效应:300 mg/LAPS诱导K562细胞后HbF合成逐渐增加,峰值在48～60 h,为未加药组的(2.10±0.19)倍(P=0),以后逐渐下降。与NaB组[(2.88±0.27)倍]比较,APS诱导K562细胞HbF合成有显著性差异(P=0)。3.APS对K562细胞的增殖作用:不同质量浓度(150、300和450 mg/L)APS和0.5 mmol/L NaB对K562细胞生长的影响不同(F=297.078 P=0)。APS的抑制作用随质量浓度升高而增强,但均弱于NaB(P=0.001)。APS和NaB各诱导K562细胞48 h抑制率分别为20.45%和79.55%,有显著性差异(P=0);诱导72 h抑制率分别为38.46%和90.11%,有显著性差异(P=0)。结论APS可诱导K562细胞HbF合成增加,其对K562细胞增殖的抑制作用较NaB弱。