^(A)γ-珠蛋白基因启动子区域-114~-102缺失突变导致非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征的研究

目的:研究^(A)γ-珠蛋白基因启动子区域-114~-102缺失突变病例的基因突变特点、血液学表型及临床表型。方法:选取2022年3月至2023年12月在广西医科大学第一附属医院检查地中海贫血的病例4例。血红蛋白(Hb)分析仪和血细胞分析仪检测全血样本,分析Hb和血常规。Sanger测序法与荧光PCR熔解曲线法检测γ-珠蛋白基因启动子区突变和β-珠蛋白基因突变。结果:共检出^(A)γ-114~-102缺失杂合子4例,Hb分析显示血红蛋白F(Hb F)水平为11.2%~37.8%,血红蛋白A2(Hb A2)水平为2.0%~3.3%,血常规分析显示Hb水平为67~114 g/L,红细胞计数(RBC)为(2.33~4.1)×10^(12)/L,平均红细胞体积(MCV)为84.02~91.9 fL,平均红细胞血红蛋白(MCH)为27.8~29.7 pg。γ-珠蛋白基因及β-珠蛋白基因突变检测结果表明:4例病例含有^(A)γ-114~-102缺失杂合子,其中2例合并有^(G)γ-158C>T突变杂合子;4例病例均合并有β-珠蛋白基因突变,基因型分别为Codon 41-42(-TTCT)杂合子突变、Codon 41-42(-TTCT)纯合子突变、IVS-Ⅱ-654(C>T)复合Codon 41-42(-TTCT)突变和Codon17(A>T)复合Codon 71-72(+A)突变。结论:首次在中国人群中发现^(A)γ-114~-102缺失杂合子,且复合β-地中海贫血的病例,临床表现为轻度或中度贫血。^(A)γ-114~-102缺失突变导致非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(nd-HPFH),能够减轻β-地中海贫血患者的贫血程度。

广州市从化区育龄人群α-珠蛋白生成障碍性贫血筛查及基因鉴定结果分析

目的了解和分析广州市从化区育龄人群中α-珠蛋白生成障碍性贫血发病率及基因突变类型。方法应用血细胞分析和血红蛋白电泳对24083例育龄人群血样进行初筛,初筛阳性者采用跨越断裂点聚合酶链反应(GAP-PCR)和PCR反向点杂交技术检测α-珠蛋白变异基因,使用PCR反向点杂交方法检测β-珠蛋白17种常见突变基因。结果经基因鉴定共检出α-珠蛋白生成障碍性贫血基因异常者2596例,异常发生率10.78%。α-β复合基因突变者170例,复合发生率0.71%。在突变基因中,包括缺失型2550例,占98.23%;非缺失型46例,占1.77%。共含有14种基因突变类型,其中血红蛋白H(HbH)病5种,以--^(SEA)/-α^(3.7)为主;轻型4种,--^(SEA)/αα基因型达到了68.61%;静止型5种,占比最高的前两种基因型为-α^(3.7)/αα和-α^(4.2)/αα。αβ复合基因突变类型检出23种,检出率最高的前六种分别为--^(SEA)/β^(CD41-42),-α^(3.7)/β^(CD41-42),--^(SEA)/β^(654),--^(SEA)/-28,-α^(3.7)/β^(654)和-α^(3.7)/βCD17,占全部复合类型的75.27%。结论广州市从化区α-珠蛋白生成障碍性贫血基因异常发生率较高,基因突变类型和构成比具有自己的特点,是α-珠蛋白生成障碍性贫血一个较为特殊的区域。

丁酸钠对K562细胞γ-珠蛋白基因启动子组蛋白磷酸化的影响

目的探讨丁酸钠(NaB)对K562细胞Gγ-珠蛋白基因和Aγ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白H3磷酸化/乙酰化(ph/acH3)的影响。方法将K562细胞按不同处理方法分为2组,即0.5 mmol.L-1NaB处理48 h的K562细胞组[K562(NaB)组]和K562亲本细胞组(K562组)。采用半定量RT-PCR测定Gγ-珠蛋白和Aγ-珠蛋白mRNA水平,采用基于Real time PCR分析的染色质免疫共沉淀(ChIP)方法分析不同处理细胞Gγ-珠蛋白和Aγ-珠蛋白基因启动子区域ph/acH3水平。结果与K562组细胞比较,K562(NaB)组细胞Gγ-珠蛋白mRNA、Aγ-珠蛋白mRNA的相对水平分别升高1.4倍(t=-149.022,P=0.000)和1.2倍(t=-13.363,P=0.000)。与K562组比较,K562(NaB)组细胞Gγ-珠蛋白和Aγ-珠蛋白基因启动子区ph/acH3水平分别升高了2.9倍(t=-12.833,P=0.006)和3.2倍(t=-10.484,P=0.000)。K562(NaB)组细胞Gγ-珠蛋白和Aγ-珠蛋白基因启动子片段的%In-put值分别比Necdin基因升高10.0倍(P=0.000)、9.5倍(P=0.000);K562组细胞的Gγ-珠蛋白和Aγ-珠蛋白基因启动子片段的%Input值分别比Necdin基因升高3.2倍(P=0.000)、2.7倍(P=0.000)。结论 NaB可促使γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白H3磷酸化及乙酰化,这一作用途径可能是NaB诱导K562细胞γ-珠蛋白基因表达的机制之一。

一种新的β-珠蛋白基因启动子突变-38G>A导致β-地中海贫血的研究

目的:研究β-珠蛋白基因启动子区-38G>A基因突变导致β-地中海贫血的临床特征以及基因型-表型相关性。方法:收集2019年7月至2020年1月在广西医科大学第一附属医院就诊的确诊为β-地中海贫血的病例412例,应用血细胞自动分析仪进行血常规检测,血红蛋白(Hb)分析仪进行Hb分析,荧光PCR熔解曲线法及DNA测序检测β-珠蛋白基因突变类型。结果:在412例β-地中海贫血病例中检出1例新的β-珠蛋白基因-38G>A(HBB:c.-88 G>A)杂合子突变,该病例轻度贫血,无黄疸、肝脾肿大,无输血史;血常规结果:Hb 108.8 g/L,红细胞计数(RBC)5.85×1012/L,红细胞平均容积(MCV)62.51fL,红细胞平均血红蛋白(MCH)18.61 pg,红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)297.7 g/L,血细胞比容(HCT)0.365;Hb分析结果:血红蛋白A2(HbA2)3.5%,胎儿血红蛋白(HbF)0.6%。结论:首次发现β-珠蛋白基因启动子-38G>A突变导致β-地中海贫血,其致病机制可能是影响与转录因子或者结合蛋白的结合,从而影响转录起始速率。其杂合子表现为轻度贫血,HbA2稍升高,为轻型β-地中海贫血。

人Aγ-珠蛋白基因-173T→C突变对启动子功能的影响

目的 研究人Ａγ珠蛋白基因－ １７３ Ｔ→Ｃ突变对反式作用因子与启动子的结合及对启动子活性的影响。方法 采用电泳迁移改变分析和荧光素酶报告基因瞬时转染分析。结果 Ａγ珠蛋白基因－ １７３ Ｔ→Ｃ突变使ＧＡＴＡ１ 与突变启动子片段（－ ２０１～－ １５８）的结合降低了９６％ （Ｐ＜ ００１），并且使Ｏｃｔ１ 与相同的ＤＮＡ 片段的结合降低５５％ （Ｐ＜ ００５）。在ＭＥＬＧＭ９７９ 细胞中，突变启动子活性是正常启动子的２ 倍（Ｐ＜ ００５）；在Ｋ５６２ 和Ｈｅｌａ 细胞中，突变和正常启动子活性基本相同。结论 Ａγ启动子－ １７３ Ｔ→Ｃ突变导致ＧＡＴＡ１ 与突变启动子片段结合显著减少，提示在成年期该转录因子可能是Ａγ珠蛋白基因的负调控因子；－ １７３

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(humanclottingfactorIX ,hFIX)的可行性 ,构建了包括山羊 β 酪蛋白基因启动子和外显子 1、内含子 1、外显子 2共约 6 .7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子 1的乳腺表达载体 ,通过转基因技术获得 12个原代转基因小鼠 (9♀ ,3♂ ) ,整合率为 11.2 %。经ELISA和Westernblot鉴定 8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性 ,其中一只的表达量高达5 2 .9mg/L ,其凝血活性亦高达 2 79.2 %。FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上。结果证明所构建的山羊 β 酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达 ,并能保持hFIX的生物活性。

鲮β-肌动蛋白基因和启动子的克隆及序列特征分析

鲮(Cirrhinus molitorella)是华南地区重要的淡水养殖品种之一,但是鲮生长速度慢,且不耐低温,是目前鲮养殖产业所面临的主要问题。作为利用转基因技术培育快速生长鲮新品系研究工作的一部分,本实验利用PCR和一种新的染色体步移方法克隆了鲮β-肌动蛋白(β-actin)基因启动子和全基因组DNA序列。鲮β-actin基因长4 351 bp,由6个外显子和5个内含子组成。鲮β-actin基因启动子区域包含1个TATA盒,1个CCAAT盒,2个CArG调控元件和1个CRE调控元件,并且鲮β-actin基因内含子1中也含有一个CArG调控元件。这些结构特征说明本研究所克隆的鲮β-actin基因序列具有典型的启动子特征。鲮β-actin基因启动子的克隆为转基因鲮表达载体的构建提供了一个重要的调控结构元件。

唐鱼β-肌动蛋白基因启动子的分离及其驱动活性的检测

利用PCR技术克隆唐鱼(Tanichthy salbonubes)β-actin基因。所克隆的β-actin基因片段为1464bp,包含长为1374bp的启动调控区和90bp的部分开放阅读框。启动调控区包括105bp的β-actin基因上游调控序列、第一个外显子和第一个内含子。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAATBox、TATABox、CArGBox等元件。将唐鱼β-actin启动调控区克隆到红色荧光表达载体pDsRed2-1上,并显微注射到唐鱼受精卵中,荧光显微镜观察红色荧光蛋白(RFP)的表达。结果表明,RFP在转基因唐鱼中的表达阳性率较高,最高可达51.8%,且RFP的表达水平较高。PCR检测转基因唐鱼的部分器官组织,在被检组织器官中均能检测到外源RFP基因;而RT-PCR以及Southernblot验证显示RFPmRNA的表达有所不同;Southern blot检测肌肉组织基因组DNA,可见比阳性载体大的杂交条带。说明所检测的组织中已发生外源基因RFP的整合,但有些组织存在表达水平较低或者不表达的现象。本实验分离到的β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能,可启动外源基因在唐鱼体内的高效表达,从而为下一步进行功能基因的转化研究奠定基础。

β-肌动蛋白启动子指导下人bcl-2转基因小鼠模型的建立

目的 :通过原核注射法将肌动蛋白启动子 /bcl 2基因转入小鼠受精卵 ,制作转bcl 2基因的小鼠 .方法 :构建 β actin启动子 /bcl 2表达载体 ,小鼠进行超排获得原核期胚胎 ,应用原核注射法进行转基因操作 ,对新生小鼠通过基因组DNAPCR和Southernblot方法进行鉴定 .结果 :注射成功率为5 8% (5 80 / 10 0 0 ) ,新生小鼠为 33只 ,PCR检测转基因阳性为 8只 ,经过Southern杂交检测有 4只转基因阳性鼠 .结论 :通过原核注射法获得转bcl 2基因的阳性小鼠 ,建立bcl 2转基因动物模型 ,为脑缺血再灌注损伤的机制研究提供手段 .

染色质免疫共沉淀分析丁酸钠对γ珠蛋白基因启动子组蛋白乙酰化的作用

目的建立基于Real-time PCR分析的染色质免疫共沉淀(ChIP)方法,探讨丁酸钠对γ-珠蛋白基因启动子区组蛋白乙酰化的作用。方法将K562细胞分为0.5 mmol/L丁酸钠处理48 h组和K562细胞组,每组取1×107细胞用实验。采用抗乙酰化组蛋白H3及H4抗体分别对两组细胞进行ChIP,荧光定量PCR分析不同处理细胞Gγ-、Aγ-珠蛋白基因启动子区乙酰化H3和H4(acH3,acH4)水平。结果各细胞组组内Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域acH3、acH4水平高于阴性对照necdin基因。与K562细胞相比,NaB处理组Gγ-珠蛋白基因启动子区acH3和acH4水平分别升高3.1和2.6倍,Aγ-珠蛋白基因启动子区acH3和acH4水平分别升高3.7和3.2倍(P<0.01)。结论建立了基于荧光定量PCR分析的ChIP技术用于研究珠蛋白基因启动子区域组蛋白的表观遗传修饰,并进一步证实了丁酸钠对γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白乙酰化的作用。

苦荞黄烷酮3-羟化酶基因FtF3H及其启动子的克隆与功能分析

【目的】克隆苦荞FtF3H基因及其启动子序列,探究该基因的生物学效应及启动子对环境因素与激素的响应。【方法】基于苦荞基因组和转录组数据克隆FtF3H基因及其启动子,对二者进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术检测FtF3H对MeJA、ABA和光处理的响应,进一步利用转基因拟南芥技术,分析FtF3H的过表达对黄酮合成的影响。【结果】苦荞FtF3H基因DNA序列长2034 bp,包括2个内含子和3个外显子;其ORF序列为1104 bp,推导的FtF3H蛋白含367个氨基酸残基,归类于2-酮戊二酸依赖性双加氧酶超家族且具有典型的植物F3H的分子特征。启动子PFtF3H在核心启动子基序外,还含有数目众多的光应答元件和激素响应元件,qRT-PCR检测结果显示,PFtF3H可强烈响应ABA、MeJA和光照的诱导。转基因拟南芥中,FtF3H的过表达可引起总黄酮含量显著增加(P<0.05),黄酮合成相关酶基因,AtANS、AtDFR和AtF′3H等的表达量显著上调(P<0.05),而拟南芥内源的AtF3H表达受到抑制(P<0.05)。【结论】苦荞FtF3H基因是一个典型的植物黄烷酮3-羟化酶,其表达受到激素和光的调控,在拟南芥中的过表达可促进黄酮的合成和积累。

噬菌体展示技术筛选HBV前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因

目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白. 方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,并对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析. 结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的43个克隆中得到20 个与HBV前-前-S抗原基因启动子特异结合的阳性克隆, 包括人类SMG-1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶、28 S核糖体、单倍型As2A线粒体、组氨酰-tRNA合成酶、脂肪醛脱氢酶、桥粒相关蛋白、MAX相互作用蛋白1等17个已知功能基因及3个未知功能基因. 结论:用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到HBV前-前- S抗原基因启动子的结合蛋白基因,为进一步研究HBV发病机制创造了新的途径.

雷帕霉素诱导β-珠蛋白家族基因座位重塑调控该基因的转换表达

β-珠蛋白基因编码异常导致的β-地中海贫血是许多亚洲国家最常见的血红蛋白病。深入研究珠蛋白基因表达的分子基础和表观遗传机制,是探索治疗地中海贫血新方案的关键。本研究利用FAIRE、3C及ChIP等主要技术方法,探讨雷帕霉素诱导CD4^(+)T细胞核内染色质重塑过程中,β-珠蛋白家族基因座位的三维相互作用网络及其重塑在功能上调控基因表达的分子机制。结果显示,雷帕霉素处理浓度从低到高的变化过程中,珠蛋白基因染色质的开放程度、基因启动子区与调控元件LCR之间的相互作用频率以及CTCF在基因启动子区的富集效率发生不同的改变,这种变化导致了基因表达模式也呈现相同的变化趋势。10 nmol/L浓度处理时,染色质可及性降低,基因表达下降(P<0.05);20 nmol/L和50 nmol/L浓度时,染色质可及性增加,基因表达上调(P<0.05)。本研究通过这种动态的变化过程阐述了β-珠蛋白家族基因表达转换调控的分子机制,为临床精准治疗提供了理论与临床实践基础。

山羊β-酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达

对本所构建的pcDNA3.1- β6 .7hALBm表达载体行尾静脉注射直接转染哺乳期母鼠的活体组织。通过RT-PCR检测hALBm基因在小鼠几种组织中的表达来研究该构建体的组织特异性。结果 :构建体在受试鼠组织中的表达显示了较好的乳腺组织特异性。说明构建具有较长 5′端上游乳蛋白调控区的乳腺特异性表达载体对组织特异性表达是必需的。

一种新的β-珠蛋白基因内含子Ⅱ碱基缺失和插入突变的基因型和表型分析

目的:分析β-地中海贫血的基因型,明确是否存在新的突变。方法:对病例进行血液学分析、血红蛋白(Hb)分析及荧光PCR及DNA测序分析地中海贫血基因突变类型。结果:共194例确诊为β-地中海贫血,其中1例为新的β-珠蛋白基因内含子Ⅱ基因突变杂合子。病例男患儿,2岁,临床有轻度贫血。Hb分析结果Hb A 92.9%,Hb A2、Hb F均升高,Hb A2为4.2%,Hb F为2.9%。基因分析显示为杂合子β-珠蛋白基因IVS-Ⅱ-561至IVS-Ⅱ-562有1个碱基缺失和13个碱基插入突变,基因突变类型为IVS-Ⅱ-561-562(-1 bp,+13 bp)。结论:新的β-珠蛋白基因IVS-Ⅱ-561至IVS-Ⅱ-562突变的杂合子导致β-地中海贫血,临床表现为轻度贫血,Hb A2水平升高。

延伸因子-1α-A和β-肌动蛋白启动子在青鳉转基因胚胎中的表达(简报)

转基因技术是二十世纪八十年代初发展起来的一项生物领域高新技术.近年来,外源基因经显微注射导人哺乳类、两栖类、昆虫类以及鱼类的受精卵或胚胎,从而使人们对在整个动物的系统发育期间外源基因表达的研究更加深入.

不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率

【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3′端ploy A序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液,提取基因组DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3′端ploy A区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列。测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入p MD18-T骨架中,构建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特异表达载体。将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系。用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在m RNA水平和蛋白质水平检测IFNα-2b的表达。【结果】PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A区序列。最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系。经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFNα-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFNα-2b基因的表达上效率较高,在m RNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P<0.05)。【结论】娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子。所构建的表达载体为IFNα-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子—目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子—Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果与结论利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。

西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因启动子区的克隆、生物信息学分析及活性研究

根据已发表的β-酪蛋白基因全序列设计合成引物,以西农萨能奶山羊乳腺组织基因组DNA为模板,通过长链PCR扩增β-酪蛋白基因组基因5'侧序列。将该序列克隆入pMD18-T载体,并对其进行序列测定。结果克隆得到西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因-4359至+2106共6465bp序列。该序列保留β-酪蛋白第一内含子、第一外显子和第二外显子及其信号肽部分。将该序列与已公布的其他山羊β-酪蛋白基因序列进行比较,其同源性为96%～98%。生物信息学分析显示,β-酪蛋白基因启动子区包含有TATA启动子序列和HOXF、Oct-1、AP1、CEBP、STAT、NFKB、GR、ER、PR和ETS等转录因子识别位点。将此6465bp片段插入荧光素酶报道基因载体pGL3-Basic中,构建重组质粒pGL3/B65,瞬时转染萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞48h后检测显示,该假设的启动子区确有启动子功能,对泌乳激素发生反应。本研究为进一步构建有效的乳腺生物反应器载体奠定了基础。

α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶基因启动子的影响作用研究

目的：探讨α-突触核蛋白对多巴胺代谢的调节机制。方法：以人基因组DNA为模板，PCR法扩增酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）基因区部分DNA片段（＋25～-495bp），将其插入质粒pGL3-Basic，构建荧光素酶报告基因重组质粒pGIm—THprom，转染多巴胺能神经元细胞系MES23．5和MES23．5／hα-Syn^＋。结果：双荧光素酶活性分析表明，pGL3-basic、pGIm—THprom和pGL3-control在MES23．5细胞中表达的荧光素酶活性分别为5．60±0．67，26．80±4．11和32．90±4．75，而pGL3-THprom在MES23．5和MES23．5／hα-Syn＋中表达的荧光素酶活性分别为26．80±4．11和14．40±0．61。