拟南芥γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)启动子的分离及表达特性分析

维生素E是一类人体所必需的脂溶性的维生素,具有重要的生理功能。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E生物合成途径中的关键酶之一,催化γ、δ-生育酚甲基化,生成α、β-生育酚。从拟南芥中分离了γ-生育酚甲基转移酶基因1552bp的启动子序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得了转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,在γ-TMT启动子的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的叶、茎以及花均有表达,且在茎尖、雄蕊和幼叶中表达最强,而在根、种子和种荚中则没有检测到GUS基因的表达,表明γ-TMT基因可能仅在拟南芥某些组织中特异性高表达。

紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因的克隆与逆境下的表达分析

紫花苜蓿是目前全国乃至世界上种植最多的牧草,在畜牧业生产中发挥着重要的作用。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径中一种重要的合成酶,催化γ-生育酚向α-生育酚的转化,改变维生素E组成,利于动物和人体的吸收。本实验通过RACE-PCR技术,得到紫花苜蓿γ-TMT基因的全长cDNA序列,命名为MsT-MT。测序和生物信息学分析表明,此序列全长1 306bp,包含1个长为939bp的完整开放阅读框(ORF),编码312个氨基酸。MsTMT属于甲基转移酶家族(AdoMet-MTases),有1个腺苷脱氨基酶信号(SLSTDDP),包含有2个保守的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(XXDXGCGIG,VXXPGGXXIX)。Real-time PCR检测结果表明MsTMT基因在紫花苜蓿各组织中均有表达,叶片中表达量最高。受NaCl、PEG以及黑暗诱导后,该基因表达上调;低温胁迫后该基因表达下降;外源ABA不影响该基因的表达。

花生γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)的克隆及序列分析

γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）催化γ-生育酚转变为生物活性最高的α-生育酚,是决定植物中维生素E成分和活性的关键酶。本研究采用电子克隆与PCR相结合的方法获得了花生6个栽培品种（A.hypogaeaL.）和花生区组4个二倍体野生种中γ-TMT的全长DNA序列,定名为AhgTMT;从栽培品种丰花2号中获得γ-TMT的cDNA序列,定名为AhrTMT。同一栽培品种的AhgTMT与AhrTMT的序列完全对应,说明该基因无内含子。AhrTMT编码区长1059bp,编码352个氨基酸残基的AhTMT蛋白。AhTMT分子量为39.09kD,等电点6.72,总平均亲水性–0.12;预测的二级结构中α-螺旋占55.40%,β-折叠占10.51%,无规则卷曲占34.09%;被定位于叶绿体,含有甲基转移酶保守的SAM结构域。AhTMT与已报道植物γ-TMT氨基酸序列的相似性为61.75%~72.80%。栽培品种的AhgTMT与A.ipaensis（BB）、A.batizocoi（BB）、A.duranensis（AA）、A.kuhlmannii（AA）4个野生种的核苷酸序列同源性分别是100%、99.91%、99.74%和95.63%。

甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆和功能验证

采用RACE技术,从甘蓝型油菜中克隆出一含1044个碱基的开放阅读框架的γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因全长cDNA。将其成熟蛋白编码区克隆进pET21b(+)多克隆位点,在大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus中表达出一个分子量为36kDa的融合蛋白。酶学分析显示,重组酶具有γ-TMT活性。

大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(Gm VTE3)的克隆及对转基因烟草种子中生育酚组成的影响

【目的】克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(GmVTE3),研究其在烟草中过量表达对转基因烟草种子中生育酚(维生素E)组分的影响。【方法】利用EST拼接和RT-PCR技术,从大豆中分离了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(VTE3)的全长cDNA序列,通过烟草转化研究过量表达VTE3对转基因植株维生素E组分的影响。【结果】GmVTE3全长1026bp,编码342个氨基酸,与其它物种的VTE3氨基酸同源性很高,在烟草中过量表达该基因使烟草种子中γ-生育酚与δ-生育酚的比值最高增加2倍。【结论】首次克隆了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因GmVTE3,它能够催化烟草植株中2-甲基-6-植基-1,4-苯醌(MPBQ)的甲基化,从而改变烟草种子中生育酚的组成成分。说明可以利用克隆的GmVTE3来改变植物种子中生育酚的组成和提高α-生育酚的含量。

油棕等植物γ-生育酚甲基转移酶的生物信息学分析

油棕果实中含有丰富的维生素E,而提高其中高活性的维生素E组分是改善棕油品质的关键。油棕γ-生育酚甲基转移酶(Gen Bank登录号为AEU17779)能将低活性的γ-生育酚三烯催化生成高活性的α-生育酚和α-生育酚三烯,是控制油棕维生素E组分和活性的关键酶,其功能在油棕等许多植物中极其保守。本研究利用生物信息学相关软件对以油棕VTE4基因为主要分析对象的一些植物VTE4基因的核酸和相应的氨基酸序列的组成成分、疏水性/亲水性、跨膜结构域以及功能结构域等进行分析。结果表明:VTE4属于不具有信号肽的亲水性蛋白,可能作为转运蛋白在叶绿体中发挥作用,α-螺旋和无规则卷曲大量散布于整个蛋白质二级结构中,具有S-腺苷甲硫氨酸结合位点和PLN02244保守结构域。这一结果可为油棕等植物VTE4的功能和分子机制研究提供更多详细的参考。

结球甘蓝γ-生育酚甲基转移酶cDNA的克隆、分析及其异源表达酶蛋白的功能研究

采用3′-和 5′-RACE技术,从结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)幼苗顶芽中克隆了γ-生育酚甲基转移酶的全长cDNA序列(BoTMT),该cDNA长1265bp,包含一个1044bp的开放阅读框,编码包括叶绿体导肽和两个S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-bindng domain)在内的347个氨基酸组成的蛋白质,序列分析表明该蛋白质与目前已知的γ-生育酚甲基转移酶有41.8％～86.5％的同源性,半定量RT-PCR结果显示BoTMT主要在结球甘蓝的花和叶器官中表达,将BoTMT的成熟蛋白编码区序列克隆至原核表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达产物占菌体总蛋白的22％,体外酶活性测定结果表明表达的蛋白质具有γ-生育酚甲基转移酶活性,能有效地催化γ-生育酚甲基化生成α-生育酚。

日本百脉根γ-生育酚甲基转移酶基因的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学方法,以拟南芥-γ生育酚甲基转移酶cDNA序列为信息探针,在GenBank的HTGs数据库中找到与之高度同源的日本百脉根基因组DNA序列——LjT44D21克隆。通过GENSCAN分析及序列拼接得到日本百脉根"γTMT基因的cDNA序列,GenBank的登陆号为DQ013360。用该序列对GenBank中的est-others进行相似性搜索,获得了44条日本百脉根的EST序列,经拼接后发现与基因组预测的基因序列一致,表明该基因是真实存在和表达的。该cDNA序列长为1 077 bp,具有完整的开放阅读框架(1～1 077 bp)。推测编码蛋白为358个氨基酸,该蛋白序列与大豆、水稻、小麦、拟南芥、油菜、苜蓿和衣藻等物种的-γTMT蛋白质序列进行了同源性比较分析,具有很高的同源性。

大豆γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与表达分析

采用电子克隆与实验克隆相结合的方法获得了大豆γ-生育酚甲基转移酶基因的cDNA序列,GenBank登录号为AY960126。序列分析结果表明,该cDNA序列含有1个编码350个氨基酸的完整的开放读码框,5′非翻译区具有2个同框终止密码子,3′端具有2个加尾信号和polyA尾巴。启动子区除含有通用核心元件外,还含有许多与光反应有关的作用元件。编码的蛋白质序列含有1个信号肽和γ-生育酚甲基转移酶的特征基序,该蛋白定位于叶绿体中。氨基酸序列比对和系统发育分析结果显示,不同物种之间γ-生育酚甲基转移酶氨基酸序列同源性较高。电子表达分析和RT-PCR组织表达分析结果表明,该基因的表达量与组织中叶绿体含量具有很高的关联,但强光逆境对该基因的表达无影响。

棉花γ-生育酚甲基转移酶基因全长cDNA的克隆与序列分析

γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）是植物维生素E生物合成途径中的关键酶。通过RACE—PCR得到了棉花γ-TMT基因的cDNA序列，全长1384bp，包含一个长为1035bp的完整开放读码框，推导的氨基酸序列与番茄、大豆、拟南芥、向日葵、玉米等植物的γ-生育酚甲基转移酶基因编码的氨基酸序列的同源性较高，序列的一致率为68％～81％；与莱茵衣藻的序列同源性较低，一致率只有54％。系统进化分析结果表明不同来源的γ-TMT基因聚为3类。

番茄γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与分析

[目的]为进一步研究γ-生育酚甲基转移酶(TMT)基因的功能奠定基础。[方法]以拟南芥γ-TMT cDNA为信息探针,在GenBankdbEST数据库中搜索与其高度同源的番茄EST序列,通过人工序列拼接得到番茄γ-TMT的cDNA序列。据此拼接序列设计1对特异引物,以番茄叶片cDNA第1链产物为模板进行RT-PCR,回收目的片段,转化到大肠杆菌DH5α进行TA克隆。最后对获得的阳性克隆进行测序,分析测序结果与其他物种中该基因之间的同源性,进行氨基酸序列比对及系统进化分析。[结果]经RT-PCR扩增出1300bp左右的片段,成功克隆了番茄γ-TMT基因。克隆片段全长1354bp,包含1个1089bp的完整开放读码框,与拼接序列完全一致。番茄γ-TMT基因编码的氨基酸序列与马铃薯、小麦、玉米和拟南芥的γ-TMT基因的同源性分别达89%、75%、75%和70%。系统进化分析表明,番茄与马铃薯的γ-TMT基因有较近的亲缘关系。[结论]该试验中克隆的番茄γ-TMT基因编码的蛋白质分子量为39.8kD,等电点为8.28。

玉米γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与分析

[目的]对玉米γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因进行克隆和分析研究。[方法]通过RT-PCR扩增得到玉米γ-TMT基因的cDNA序列,同时对序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统进化分析。[结果]玉米γ-TMT基因cDNA全长1 310 bp,包含一个长为1 059bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与小麦和水稻等高等植物的γ-TMT基因同源性较高,序列一致率为69%～87%;与低等生物褐藻的序列同源性较低,一致率只有56%。系统进化分析表明不同来源的γ-TMT基因可聚为3类。[结论]为进一步研究γ-TMT基因的功能奠定了基础。

水稻γ-生育酚甲基转移酶基因全长cDNA的克隆与分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是植物维生素E生物合成途径中的关键酶。通过RACE-PCR得到了水稻γ-TMT基因的cDNA序列,该基因的cDNA全长1 432 bp,包含一个长为1 089 bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与小麦、玉米、向日葵、番茄、大豆、拟南芥的γ-生育酚甲基转移酶基因的同源性分别为90%、87%、76%、75%、74%、70%。

转γ-生育酚甲基转移酶基因大豆的获得

以大豆子叶节为外植体 ,利用γ -生育酚甲基转移酶基因 (γ -TMT )的种子特异性表达载体 p7S -TMTL ,通过农杆菌介导法转化大豆 ,获得 2 6株抗卡那霉素再生植株。PCR检测结果表明其中 4株为阳性 ,初步证明γ -TMT已整合到这 4株大豆的基因组中。

拟南芥γ-生育酚甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E生物合成途径中的关键酶之一,催化γ、δ-生育酚甲基化,生成活性较高的α、β-生育酚。研究构建了含有γ-TMT启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,筛选出PCR阳性植株,进行GUS组织化学染色,结果表明,在γ-TMT启动子的驱动下,报告基因GUS在烟草的根、茎、叶中均有表达。

忽地笑γ-生育酚甲基转移酶基因LaTMT的克隆与表达分析

采用RACE技术从忽地笑〔Lycoris aurea（L’Hér.）Herb.〕叶片中克隆获得γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）基因,命名为La TMT。序列分析结果显示：该基因c DNA全长1 458 bp,其中开放阅读框（ORF）长1 017 bp,编码338个氨基酸残基。La TMT基因编码蛋白质的理论相对分子质量37 560,理论等电点p I 8.70,为亲水性蛋白,无跨膜结构但具有信号肽结构;并具有S-腺苷甲硫氨酸（SAM）甲基转移酶保守结构域,包含3个SAM结合位点;该蛋白的二级结构中包含44.08%的α-螺旋、32.84%的无规则卷曲、12.72%的延伸链和10.36%的β-转角。序列比对和系统进化树分析结果显示：La TMT蛋白属于S-腺苷甲硫氨酸-依赖性γ-生育酚甲基转移酶家族,与其他植物γ-TMT蛋白的一致性为64%-75%;在NJ系统树上,La TMT蛋白与单子叶植物γ-TMT蛋白聚为同一大类,并与油棕（Elaeis guineensis Jacq.）Eg TMT和美洲油棕〔Elaeis oleifera（Kunth）Cortés〕Eo TMT聚为同一类,亲缘关系最近。基因表达分析结果显示：La TMT基因可在大肠杆菌中成功表达,且表达量随异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导时间的延长而增加;在忽地笑的根、叶片、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鳞茎中La TMT基因均可表达,其中在叶片中的相对表达量最高,在子房、雄蕊和鳞茎中的相对表达量相对较低,具有明显的组织特异性。研究结果表明：忽地笑La TMT基因在进化过程中具有很高的保守性;该基因主要定位于叶绿体中,并与忽地笑对非生物逆境胁迫的抗性相关。

大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(GmVTE3)对转基因拟南芥生育酚组成的影响

2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQ-MT,VTE3)是维生素E合成途径中的关键酶之一,通过转化模式植物拟南芥,研究大豆VTE3(GmVTE3)基因在拟南芥中过量表达对维生素E组分含量的影响。成功构建了植物表达载体pZP212-GmVTE3,将其转入模式植物拟南芥,获得转基因纯系植株6个;利用HPLC检测技术对转基因拟南芥种子和叶片中维生素E含量进行了测定。结果表明:6个转基因纯系植株种子中,γ-生育酚/δ-生育酚比值均比野生型有所提高,为野生型的1.7倍;叶片中未检测到δ-生育酚。表明GmVTE3可以有效地把δ-生育酚转化为γ-生育酚,从而改变植物体内VE的组成。

利用农杆菌介导法将γ-生育酚甲基转移酶基因导入油菜的研究

将γ-生育酚甲基转移酶基因导入油菜,旨在提高菜油中的维生素E含量。为了使该基因在油菜种子中特异表达,采用油菜种子特异启动子BcNA1,构建了植物表达载体pBIBE。以花油五号和花油六号油菜品种子叶柄为受体,将γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)通过农杆菌介导法转化油菜,获得了22株抗卡那霉素再生植株。经过PCR检测,其中有7株表现为阳性,初步证明γ-TMT已整合到油菜基因组中。

强迫症与儿茶酚-邻-甲基转移酶基因多态性的关联分析

目的 探索上海地区汉族人口中儿茶酚 邻 甲基转移酶 (COMT)基因多态同强迫症的关系。方法 采用聚合酶链反应扩增技术与限制性片段长度多态 (PCR RFLP)测定 10 0例强迫症 (OCD)患者和 115例健康对照的基因型。结果 强迫症患者COMT基因型与等位基因分布与健康对照之间显著差异 (P >0 0 5 ) ;OCD患者与健康对照同性别之间COMT基因型与等位基因分布也未见显著差异(P >0 0 5 )。

安神定志灵对注意缺陷多动障碍模型脑组织儿茶酚-氧位甲基转移酶含量的影响

目的观察安神定志灵对注意缺陷多动障碍(ADHD)动物模型-自发性高血压大鼠(SHR)纹状体多巴胺转运体(DAT)表达的影响,探讨该药治疗ADHD的作用机制。方法 SHR大鼠随机分为模型对照组、安神定志灵高、中、低剂量组,Wistar-Kyoto(WKY)大鼠为正常对照组。安神定志灵高、中、低剂量组分别按生药剂量3.41、1.71、0.85g/mL灌胃;模型对照组和正常对照组以2mL/100g生理盐水灌胃,连续给药2周后处死大鼠,取脑用ELISA检测各组大鼠脑组织中儿茶酚-氧位甲基转移酶(COMT)含量。结果模型对照组、安神定志灵低、中、高剂量组与对照组比较具有显著性差异(P<0.01);安神定志灵低、中、高剂量组脑组织中COMT含量较模型对照组均降低,差异有显著性(P<0.01);安神定志灵中剂量组与高剂量组两组间COMT含量没有显著性差异(P>0.05);安神定志灵低剂量组与对照组两组间COMT含量差异没有显著性(P>0.05)。结论:SHR大鼠(ADHD模型鼠)脑组织中COMT含量存在改变,说明COMT在ADHD的发病中具有一定意义;安神定志灵对其有着调节作用。