手掌参γ-硫素的原核表达及纯化

目的:在原核系统中高效表达手掌参γ-硫素,并对其进行纯化。方法:通过筛选手掌参cDNA文库获得γ-硫素基因(gcthionin),分别对其全长及信号肽编码序列缺失的cDNA片段进行PCR扩增,克隆入原核表达载体pET-32(a),构建重组质粒pET-32(a)/gcthionin和pET-32(a)/Δgcthionin;测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白;SDS-PAGE分析后,采用Ni-NTA亲和层析柱及凝胶柱对可溶性蛋白进行纯化,Western blotting鉴定。结果:gcthionin基因开放式阅读框全长225nt,编码一个由74个氨基酸残基组成的蛋白;带有信号肽的重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达;信号肽缺失可以极大地提高外源蛋白的可溶性,该可溶性产物经Ni-NTA柱及凝胶过滤后可获得纯度较高的蛋白,经Western blotting分析,相对分子质量约21.9×103处有明显的蛋白条带,与预期蛋白分子大小一致。结论:信号肽编码序列缺失的Δgcthionin可在大肠杆菌中可溶、高效表达。