靶向γ-谷氨酰羧化酶的出/凝血药物筛选体系的建立及初步应用

维生素K依赖性凝血缺陷Ⅰ型疾病(vitamin K-dependent coagulation factors deficiency 1,VKCFD1)是一种罕见的常染色体隐性遗传出血性疾病,由γ-谷氨酰羧化酶(gamma-glutamyl carboxylase,GGCX)基因突变引起。目前,VKCFD1的主要治疗药物是维生素K_(1),但由于其并非直接靶向GGCX,临床效果存在巨大的个体差异。因此,筛选直接针对GGCX的靶向药物十分必要,而关键是构建靶向GGCX的药物评价体系。本研究基于维生素K环氧化物还原酶(vitamin K epoxide reductase,VKOR)基因敲除的细胞系(DKO HEK293),利用CRISPR/Cas9技术将内源性GGCX进一步敲除(GCKO细胞系)。随后,将致病突变的GGCX(I532T)与凝血因子X(coagulation factor X,FX)或抗凝因子C(protein C,PC)稳定双表达形成报告细胞系。基于该细胞系,通过检测FX和PC的羧化效率,进行GGCX靶向药物的初步筛选。结果发现,血根碱和高三尖杉酯碱抑制细胞增殖,几乎完全抑制FX和PC的羧化活性。原阿片碱、尿囊素和顺式乌头酸同时显著提高FX和PC的羧化活性,且与细胞增殖无关。此外,京尼平、地奥司明、番泻苷A和(+)-儿茶素水合物对FX羧化活性具有显著的促进作用,而苯乙酰胺和硝酸硫胺素则对PC羧化水平具有显著的促进作用,表明本研究所建立的以GGCX为靶点的出/凝血药物筛选体系可以高效、及时反馈药物针对FX和PC的羧化水平的影响,为筛选治疗VKCFD1的药物提供有力的工具和参考。

模拟失重大鼠腰椎骨非胶原蛋白变化与骨矿盐丢失

为研究模拟失重条件下骨质中非胶原蛋白变化与骨矿盐丢失的关系以及了解骨钙素质量是否发生变化，观察了悬吊模拟失重２１ｄ大鼠第３腰椎（Ｌ３）中骨钙素（ＯＣ），白蛋白和矿盐含量的变化，同时也观察了血清ＯＣ与羟磷灰石的结合力。结果显示：悬吊模拟失重大鼠Ｌ３中ＯＣ白蛋白和矿盐含量显著降低，血清总ＯＣ和与羟磷灰石高亲合力ＯＣ显著降低，而与羟磷灰石低亲合力ＯＣ含量无改变。

人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶基因启动子区克隆与活性分析

目的克隆人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶（GGCX）基因5’侧翼启动子区，并对其转录活性进行分析。方法对GGCX基因5’侧翼区进行生物信息学分析，预测其转录调控区域；从人肾组织中提取基因组DNA，以其为模板扩增GGCX基因启动子区，通过酶切鉴定及测序分析无误后，将其构建至萤光报告基因载体pGL3-basic中，瞬时转染至Hela细胞，检测萤光素酶水平，从而分析扩增启动子区的转录活性。结果成功克隆长度为804bp（-891～-88）的GGCX基因启动子片段，并构建相应的萤光素酶重组子pGL3-GGCX Promoter，转染Hela细胞48h后检测萤光素酶活性显示，pGL3-GGCX Promoter与空质粒对照pGL3-basic相对萤光素酶值分别为16．924-4、01与0．02±0．01，pGL3-GGCX Promoter萤光素酶活性显著增强（P〈0．05）。Matlnspector等分析显示该片段具有多个转录因子结合位点。结论成功构建含有GGCX基因启动子序列的萤光素酶报告系统，为进一步研究GGCX基因功能及其转录调控奠定了基础。

草酸钙尿石症患者肾组织γ-谷氨酰基羧化酶基因启动子序列分析及其活性研究

目的分析草酸钙尿石症患者肾组织γ-谷氨酰基羧化酶（GGCX）基因启动子序列多态性，并探讨该序列变化对启动子活性的影响。方法分别以42例草酸钙尿石症患者肾组织（尿石组）与31例非结石肾组织（肾肿瘤癌旁正常组织，对照组）基因组DNA为模板，PCR扩增GGCX基因5’-侧翼启动子区1329bp片段（-1270-＋58bp），电泳鉴定后，分别对两组PCR产物测序。筛选差异启动子序列克隆至萤光素酶报告基因载体pGL3-basic，转染293细胞，双萤光素酶检测启动子活性。结果与Ensembl正常序列比较，尿石组启动子片段测序共发现4处变异位点，-804bp处TT缺失（refsnp ID：rs11433794），-704bp处A→G、-511bp处A→G、-115bp处T→C。其中尿石组rsll43794SNP发生明显高于对照组（P〈0．05）。构建含rs11433794SNP位点的萤光素酶重组子pGL3-GGCX Promoter（804TT），与正常序列的重组子pGL3-GGCX Promoter比较，pGL3-GGCX Prorooter（804TT）转录活性明显下降（P〈0．01）。结论GGCX启动子区rs11433794SNP位点可能与草酸钙尿石症发生存在一定关系，该SNP位点可导致启动子转录活性下调，导致GGCX基因表达下降。

维持性血液透析患者动脉钙化与维生素K关系的研究进展

维持性血液透析患者中普遍存在动脉钙化现象,动脉钙化的发生与心血管事件的发生密切相关。基质γ-羧基谷氨酸蛋白(matrixγ-carboxyglutamate protein,MGP)作为一种维生素K依赖蛋白,可以通过多途径抑制动脉钙化的进展。研究证实,去磷酸化、未羧化基质γ-羧基谷氨酸蛋白(dephosphorylated-uncarboxylated matrix γ-carboxyglutamate protein,dp-ucMGP)作为一类无活性MGP,与维持性血液透析患者死亡风险相关。维生素K作为维生素K依赖蛋白(vitamin K-dependent proteins,VKDPs)活化的重要底物,决定了循环VKDP水平。在维持性血液透析患者中,补充维生素K可以显著降低去磷酸化、未羧化基质γ-羧基谷氨酸蛋白水平,但尚缺乏相关前瞻性研究明确存在动脉钙化的维持性血液透析患者是否可以从补充维生素K中获益。

重组人凝血因子Ⅶ在HEK293细胞中的瞬时表达

[目的]在HEK293细胞中表达人凝血因子Ⅶ(human coagulation factor,hFⅦ)蛋白。[方法]通过PCR分别扩增与hFⅦ羧基化有关的酶(γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)和维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1))基因序列,与hFⅦ基因片段构建真核表达载体p CAEVKORC1-GGCX-hFⅦ,利用脂质体将表达载体转入HEK293细胞,采用Western blotting和ELISA方法检测细胞上清中hFⅦ的表达水平,凝血因子Ⅶ检测试剂盒测定hFⅦ的促凝血活性。[结果]Western blotting检测细胞上清中含有hFⅦ蛋白,经ELISA检测表达量为12 mg/L,凝血因子Ⅶ检测试剂盒测定hFⅦ的促凝血相对比活性为612%。[结论]该表达载体成功在HEK293细胞中瞬时表达hFⅦ蛋白,为进一步深入研究hFⅦ的生物学特性奠定了基础。

短刺加电针法对膝骨关节炎兔膝关节软骨修复的影响

目的:观察短刺加电针法对膝骨关节炎兔软骨γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)、基质金属蛋白酶(MMP)13及血清非羧化基质GLA蛋白(ucMGP)的影响,探讨短刺加电针法对软骨组织的修复作用。方法:新西兰大白兔随机分为正常组10只和造模组30只,造模组动物采用Hulth-Telhag法手术复制膝关节炎模型,将造模成功的动物随机分为模型组、短刺组、普通针刺组,每组10只。短刺组取左侧"内膝眼""外膝眼""阴陵泉""足三里""梁丘",采用短刺法加用电针,普通针刺组常规针刺以上穴位加用电针,均每日治疗1次,每次20min,5d为一疗程,共4个疗程。采用蛋白免疫印迹法检测软骨细胞中GGCX、MMP 13的蛋白表达;免疫组化法检测GGCX的活性;酶联免疫吸附测定法检测血清ucMGP的含量。结果:与正常组相比,模型组膝关节软骨中MMP 13、血清ucMGP表达明显提高(P<0.01,P<0.05),而GGCX表达量下降(P<0.01);与模型组相比,短刺组和普通针刺组MMP 13、ucMGP表达明显降低(P<0.01,P<0.05),而GGCX表达升高(P<0.01);与普通针刺组相比,短刺组MMP 13、ucMGP表达明显降低(P<0.01,P<0.05),而GGCX表达升高(P<0.01)。结论:普通电针法与短刺加电针法均可促进膝关节软骨细胞修复,且短刺法有一定的优势,其治疗作用可能与上调GGCX表达,促进MGP羧基化,抑制MMP 13表达有关。

中国人GGCX G3261A基因多态性分析

目的了解γ-谷氨酰羧化酶(γ-glutamylcarboxylase,GGCX)基因多态位点G3261A在中国人群中的分布情况。方法标准酚-氯仿法提取273份健康人外周血基因组DNA,应用聚合酶链反应/变性高效液相色谱(PCR/DHPLC)技术检测GGCXG3261A位点基因型。结果 273例无关个体中,基因型GG、GA和AA分别有110例、138例和25例,各占40.29%、50.55%和9.16%,G和A等位基因的频率分别为65.57%和34.43%。结论获得中国人GGCXG3261A等位基因和基因型分布,为GGCXG3261A基因多态性与中国人华法林用量个体差异相关性的研究打下基础。

遗传因素对华法林维持剂量影响的研究现状

华法林是最常应用的口服抗凝药物之一。许多研究已证实华法林维持剂量的个体差异与基因型密切相关,尤其是细胞色素P450 2C9(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合物1(VKORC1)的基因型对华法林的影响受到广泛认同;尽管还有其他很多基因型被报道与华法林剂量有关,但其具体影响结论不一。研究发现纳入基因信息和临床数据的剂量计算公式可预测华法林的维持剂量,由于目前已开展的临床试验结果不一,其实用性亦受到质疑。下一步研究需要更大样本量及多中心的研究,以期进一步阐释遗传与非遗传因素对华法林剂量的影响,同时对已构建的模型进行验证或构建新模型,提高对华法林个体差异的解释百分比。

GGCX基因致病性变异相关表型的部分研究进展

γ-谷氨酰羧化酶(γ-glutamyl carboxylase,GGCX)又称维生素K依赖性谷氨酰羧化酶,通过对维生素K依赖性蛋白特定的谷氨酸残基进行γ-羧基化修饰,参与凝血、骨代谢、血管钙化和细胞增殖等多种生物学过程。早期研究发现GGCX基因致病性变异导致凝血缺陷,该表型被称为维生素K依赖性凝血因子缺乏症1。近年来发现GGCX突变还可以导致其它多种临床表型,包括皮肤、眼科、骨和心脏的异常。其中皮肤异常表型最为常见,该表型被称为类弹性假黄瘤样综合征。本文就GGCX基因致病性变异相关表型进行综述,以期提高对相关遗传病的认识,从而有助于诊断和治疗。

新疆地区不同民族GGCX rs 11676382基因多态性分析

目的了解γ-谷氨酰羧化酶（γ-glutamine carboxylase，GGCX）基因多态位点rs11676382在新疆维吾尔族、汉族人群中的分布情况及其关联性。方法以维吾尔族、汉族获得华法林稳定剂量的患者各100例作为病例组，以维吾尔族、汉族健康人群各100例作为对照组，所有人群均从外周静脉血中提取基因组DNA，采用聚合酶链反应／限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术检测GGCX基因rs11676382位点基因型及等位基因频率，比较维吾尔族、汉族之间基因多态性的差异。结果①获得了新疆地区维吾尔族、汉族人群的GGCX基因rs11676382位点多态性分布；②病例组和对照组GGCX基因rs11676382位点基因型频率和等位基因频率比较有统计学意义（P〈0．05）；维吾尔族病例组和汉族病例组GGCX基因rs11676382位点基因型频率和等位基因频率比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论获得了GGCX基因rs11676382位点在新疆地区不同民族的等位基因和基因型的分布。以及该基因位点在维吾尔族、汉族获得华法林稳定剂量患者中的分布存在民族差异。

VKORC1基因rs9923231及GGCX基因rs2592551位点多态性与新疆维吾尔族、汉族人群心源性脑栓塞的相关性研究

目的:探讨维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1)基因rs9923231及γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因rs2592551位点多态性同新疆维吾尔族和汉族人群发生心源性脑栓塞的关系。方法:选取2017年1月至2018年10月曾就诊于新疆医科大学第六附属医院神经内科的维吾尔族和汉族散发性房颤致脑栓塞患者各50例做为病例组,同时选取非心源性脑卒中维吾尔族患者50名及汉族患者150名为对照组,从外周静脉血中提取基因组DNA,采用PCR-RFLP技术检测VKORC1基因rs9923231及GGCX基因rs2592551多态性位点在不同人群中的分布。结果:维吾尔族脑栓塞组及对照组VKORC1基因rs9923231多态性位点基因型频率分布差异有统计学意义(P<0.05);汉族脑栓塞组及对照组VKORC1基因rs9923231多态性位点基因型频率的分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。GGCX基因rs2592551多态位点在汉族、维吾尔族脑栓塞组及对照组的分布差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:VKORC1基因rs9923231多态性可能与新疆维吾尔族人群心源性脑栓塞的发病有关,而与汉族人群无关;GGCX基因rs2592551多态性可能与维吾尔族及汉族人群心源性脑栓塞的发病均无关。