Bacillus methylotrophicus γ-聚谷氨酸合成酶基因的克隆表达

研究了一株非谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)产生菌Bacillus methylotrophicus SK19.001合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达。以p ET-28a(+)载体构建含有pgs BCA合成酶基因的表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21构建重组菌。结果表明,在分别以葡萄糖和谷氨酸为底物的培养基中,重组工程菌都具有合成γ-PGA的能力,说明pgs BCA合成酶基因对于B.methylotrophicus SK19.001产γ-PGA是必需的。pgs BCA合成酶基因序列比对的结果的表明,pgs B和pgs C基因编码的氨基酸序列相对保守。

聚-γ-谷氨酸合成酶复合体A的原核表达及其多克隆抗体的制备

以pgsBCA质粒为模板对已知的pgsA进行PCR扩增,得到长度为1 116 bp的片段。将获得的PgsA基因连接到pQE-30表达载体,转化大肠埃希菌后用IPTG诱导其表达,经SDS-PAGE和Westernblot分析,均可见约42 ku目的蛋白带。通过Ni-NTA agarose纯化,获得较高纯度的重组蛋白,经基因定量仪测定其浓度可达1.5 mg/mL;以其免疫新西兰兔获得免疫血清,Western blot分析证实,该重组蛋白具有良好的反应原性,用间接ELISA检测抗体效价可高达1∶12 800。结果表明,成功获得了pgsA的多克隆抗体。