核盘菌γ-谷氨酰磷酸还原酶基因SsGPR1的功能分析

【目的】γ-谷氨酰磷酸还原酶是真菌脯氨酸合成途径中的一个关键性酶,本研究旨在对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)γ-谷氨酰磷酸还原酶编码基因SsGPR1进行沉默,并对沉默转化子菌丝生长、菌核形成和致病力等表型进行研究,为揭示核盘菌的生长发育与致病机理打下基础,并为作物菌核病的绿色防控提供线索。【方法】通过BLAST进行蛋白同源比对分析,并利用MEGA 5.0软件构建蛋白进化树。通过实时荧光RT-PCR检测SsGPR1在核盘菌菌丝生长、菌核发育和萌发的各个阶段以及致病不同时期的表达模式。根据RNA干扰原理构建SsGPR1的沉默载体,通过PEG介导原生质体转化的方法将沉默载体转入到野生型核盘菌菌株1980中。利用实时荧光RT-PCR鉴定基因沉默转化子,对沉默转化子的菌丝形态、生长速度和菌核形成等表型进行观察,并测定沉默转化子在氧化胁迫条件下的菌丝生长。将沉默转化子分别接种至活体油菜叶片和拟南芥植株,观察并测量病斑大小。通过酸性茚三酮法对沉默转化子中的游离脯氨酸进行测定。【结果】核盘菌SsGPR1全长1 454 bp,编码449个氨基酸,在氨基酸H^(10)-N^(426)处含有谷氨酰磷酸还原酶结构域。同源比对发现SsGPR1蛋白与灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的BC1G_13183蛋白和白霉病菌(Sclerotinia borealis)的SBOR_2215蛋白相似性最高,氨基酸序列一致性分别达95%和94%,系统进化树结果表明三者聚为一个小的分支。SsGPR1在核盘菌菌丝生长时期的表达量较高,在菌核不同发育阶段表达量相近,但均低于菌丝生长时期。SsGPR1在致病时期表达量不断升高,在接种后9 h表达量最高。将SsGPR1基因沉默载体pSIGPR1导入到核盘菌野生型菌株中,并通过实时荧光RT-PCR检测不同转化子中SsGPR1的表达水平,结果表明SiGPR1-104和SiGPR1-149为SsGPR1基因沉默转化子。沉默转化子在PDA培养基上形成的菌核数量及均重与野生型菌株无显著性差异,且菌核均能萌发形成子囊盘,但菌丝生长稠密,生长速度显著下降。在含有H_2O_2的培养基中,SsGPR1基因沉默转化子菌丝生长受到更强的抑制,表明沉默转化子对氧化胁迫更加敏感。SsGPR1基因沉默转化子在活体油菜叶片和拟南芥植株上能引起发病,但病斑面积减小,表明沉默转化子致病力减弱。SsGPR1基因沉默转化子菌丝中的游离脯氨酸含量与野生型菌株相比无显著差异。【结论】SsGPR1与核盘菌的生长和菌丝形态相关,且参与核盘菌对氧化胁迫的抵御及致病过程。

补充复方1,6-二磷酸果糖及谷氨酰胺对训练大鼠游泳运动能力和运动后骨骼肌损伤的影响

目的:探讨补充复方1,6-二磷酸果糖(FDP)和谷氨酰胺对训练大鼠运动能力与运动后骨骼肌损伤的影响。方法:76只雄性Wistar大鼠被随机分为安静对照组、运动对照组、训练组、训练加补充谷氨酰胺组和训练加补充活性糖组。游泳训练6周后,除安静对照组外,其余大鼠进行1次力竭游泳运动,记录力竭时间;检测各组大鼠血浆CK及其同工酶活性变化;取比目鱼肌制备电镜切片,观察骨骼肌细胞Z线变化。结果:训练加补充活性糖组大鼠力竭游泳时间显著长于训练组和训练加补充谷氨酰胺组(P<0.05),训练加补充谷氨酰胺组大鼠运动后即刻比目鱼肌Z线异常率分别显著低于对照组和训练加补充活性糖组(P<0.05),训练组大鼠力竭运动后即刻比目鱼肌Z线异常率亦分别显著低于对照组和训练加补充活性糖组(P<0.05)。结果提示,补充活性糖有助于提高训练大鼠的运动能力;补充谷氨酰胺对于降低运动导致的骨骼肌细胞损伤是否有积极作用尚待进一步探讨。

联合检测尿碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶在糖尿病肾病中的诊断价值

目的探讨尿碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶在糖尿病肾病中的诊断准确率。方法检测并分析74例单纯2型糖尿病患者和38例2型糖尿病肾病患者血液和尿液生化标志物。血液检测指标主要有空腹血糖、果糖胺、血清肌酐、肾小球滤过率、血清尿酸及血清白蛋白等;尿液检测指标主要包括:尿肌酐、尿白蛋白、尿碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和尿γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltransferase,GGT)。结果 2型糖尿病肾病患者尿碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶含量是单纯2型糖尿病患者的3倍。此外,尿ALP和尿白蛋白(r=0.305,P<0.05),尿GGT和尿白蛋白(r=0.439,P<0.05)之间都存在正相关关系。GGT和ALP的受试者工作特征曲线下面积(area under roc curve,AUC)分别为0.7696(P<0.05)和0.7233(P<0.05)。当尿GGT临界浓度设为72 u/g肌酐时,糖尿病肾病诊断的敏感性为96.0%,特异性为52.5%;当尿ALP临界浓度设为20 u/g肌酐时,糖尿病肾病诊断的敏感性为83.8%,特异性为36.8%。结论尿ALP、GGT能够用于2型糖尿病肾病的诊断,且GGT的诊断价值优于ALP。

植物萜类合成酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶研究进展

综述了近年来植物萜类合成酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(DXR)的研究进展,指出DXR是萜类物质生物合成途径中的关键酶,从植物中克隆出的DXR基因结构相似,表达于植株的大部分器官中;它们大多与植物体内萜类物质的合成有关,植株体内上调DXR基因有可能增加萜类物质的含量。

蔗糖对水稻幼苗叶片谷氨酰胺合成酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的影响

报道了在光照和暗处培养下 ,不同浓度的蔗糖对水稻幼苗叶片 GS及其同工酶、1,5 -二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 (Rubisco)的影响。无论是在光照或在暗处 ,蔗糖对 GS活性均有抑制作用 ,尤其是在较高蔗糖浓度下作用更为明显 ;虽然 Rubisco及可溶性蛋白的水平在光照和暗处有显著的差别 ,但蔗糖对其未见明显影响。 Native-PAGE与活性染色表明 ,在光照下或在暗处 ,蔗糖对 GS2的抑制作用随蔗糖浓度升高而加强 ,但对 GS1未有明显影响。这些结果提示 ,在水稻幼苗生长中 ,蔗糖不能象光一样诱导叶片

血清γ-谷氨酰转移酶与碱性磷酸酶在胆囊结石合并胆总管小结石诊断中的临床意义

目的:探讨血清γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)在胆总管小结石诊断中的临床意义。方法:回顾性分析48例胆总管小结石患者的血清GGT、ALP的含量,并观察治疗前后GGT、ALP含量的变化。结果:治疗前后48例胆囊结石合并胆总管小结石患者GGT、ALP含量比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:血清GGT与ALP同步明显升高可作为胆囊结石患者合并胆总管小结石诊断的一项敏感性指标。GGT、ALP可成为胆囊结石患者可能合并胆总管小结石的初步预测因子,避免胆总管结石的漏诊。

谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰基转移酶抑制剂细胞筛选模型的建立

目的 建立己糖胺途径的关键酶谷氨酰胺∶6 磷酸果糖酰基转移酶(glutamine∶fructose 6 phosphateamidotransferase,GFAT)抑制剂的细胞筛选模型。方法 用改进的GDH法测定GFAT的活性。以速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取观察细胞对胰岛素的反应性;用长效胰岛素诱导HIRc细胞,形成己糖胺途径过度活跃和胰岛素抵抗的细胞模型,并应用该细胞模型和GDH法筛选GFAT抑制剂。结果 用25nmol·L-1长效胰岛素刺激HIRc细胞36h,可明显激活己糖胺途径,使GFAT活性上升47%;同时产生胰岛素抵抗,使速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取能力降低21%。Azaserine可明显抑制该模型中GFAT的活性。结论 长效胰岛素既可过度激活HIRc细胞己糖胺途径,又可使其产生胰岛素抵抗。该模型可用于筛选GFAT抑制剂。

血清γ-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶在胆总管小结石诊断中的临床价值

目的研究并探讨血清γ-谷氨酰转移酶(gamma glutamyl transferase,GGT)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)在胆总管小结石诊断中的临床应用价值。方法选取2013年1月至2016年12月河北省廊坊市固安县人民医院和固安县中医院接收的150例疑似合并胆总管小结石的胆囊结石患者,对其进行胆囊切除术,术中探查胆管以明确是否存在胆总管小结石。另选取50例健康体检正常者作为对照组,胆囊结石患者手术前、对照组体检者均接受血清GGT和ALP测定,统计GGT和ALP阳性检出结果,以手术诊断结果为金标准,分析GGT和ALP对胆总管小结石的诊断结果。将手术确诊胆总管小结石患者归为阳性组,其余归为阴性组,比较阳性组、阴性组和对照组的血清GGT和ALP表达水平。结果 150例胆囊结石患者中,共有98例患者经手术探查明确合并有胆总管小结石。GGT和ALP对胆总管小结石的诊断灵敏度、特异度、准确性比较差异无统计学意义(P>0.05),其诊断结果与手术诊断结果之间均具有良好的一致性(Kappa=0.735、0.719)。对照组、阴性组和阳性组患者的血清GGT和ALP表达水平比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论在胆总管小结石的诊断中,测定血清γ-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶可有效检出胆总管结石,可作为胆总管小结石的辅助诊断指标。

利用柞蚕核型多角体病毒表达系统表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶

谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸。将该基因连接到柞蚕杆状病毒转移载体pApM748BE后与ApNPV-Δph/egfp+共转染Tn-High Five细胞获得重组病毒。将重组病毒注射到柞蚕蛹体内,收集发病蛹血淋巴,用镍离子螯合柱纯化得到纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测表明,ApGFAT蛋白在柞蚕蛹体内得到成功表达,酶活力为0.978μmol/(min·mg)。

α-硫辛酸对糖尿病小鼠骨骼肌谷氨酰胺6磷酸果糖转氨酶1表达的影响

测定了四氧嘧啶制成的糖尿病小鼠模型骨骼肌的谷氨酰胺-6磷酸果糖转氨酶1(GFAT1)的mRNA表达水平。给予α硫辛酸治疗的糖尿病小鼠,骨骼肌内丙二醛水平低于不予治疗的糖尿病小鼠,而骨骼肌内GFAT-1的mRNA表达水平也低于不治疗组。

人谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺转移酶的体外表达、纯化及活性检测

目的:制备重组谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰胺转移酶(GFAT),检测其活性。方法:利用RT-PCR扩增人肝脏cDNA中GFAT1基因全长片段,克隆到表达载体pET32b中;在大肠杆菌Origami(DE3)中诱导表达,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组GFAT1;用体外酶学的方法检测GFAT的活性。结果:构建了pET32b-GFAT1质粒,经诱导表达及纯化,得到具有一定生物活性的GFAT。结论:利用原核表达系统可得到具有良好生物学活性的重组人GFAT1。

谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺基转移酶多克隆抗体的制备及应用

目的:采用原核表达系统表达和纯化重组谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰胺基转移酶(GFAT),制备GFAT多克隆抗体,并用以研究在糖尿病发生发展过程中GFAT的表达情况。方法:通过生物信息学分析其抗原性和属间同源性,选择需要的基因区域;利用RT-PCR扩增小鼠肝脏cDNA中GFAT基因片段,克隆到表达载体pET28b中;在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组GFAT;用纯化的重组GFAT免疫BALB/c小鼠后得到多克隆抗体;用Western印迹检测正常小鼠、高血糖小鼠及胰岛素抵抗小鼠的组织GFAT的表达。结果:Western印迹分析表明,制备的GFAT抗体具有较高的特异性,可特异性识别重组GFAT和正常小鼠肝脏、肾脏、骨骼肌和肺组织的GFAT;与正常小鼠相比,高脂饲料诱导的胰岛素抵抗小鼠肌肉组织的GFAT表达升高约1.8倍,肝脏组织则略有升高;高血糖小鼠肌肉组织和肝脏组织的GFAT表达也略有上升,但无统计学差异。结论:利用原核表达及Ni-NTA纯化系统可制备小鼠GFAT多克隆抗体;正常小鼠骨骼肌GFAT表达较高;肌肉组织的GFAT表达在胰岛素抵抗小鼠显著性升高,而与小鼠血糖水平无明显相关性。

血清γ-谷氨酰转移酶与碱性磷酸酶在不同肝胆疾病中的临床研究

目的:探讨血清γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)在不同肝胆疾病中的变化及临床意义。方法:检测137例不同肝胆疾病病人的血清GGT、ALP的含量,并观察各组GGT、ALP的变化。结果:A组(肝外胆道梗阻、肝癌、自身免疫性肝病、酒精性肝炎)GGT升高最明显,与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05);血清GGT大于正常值8倍以上的以肝外胆道梗阻、酒精性肝炎占的比例最高;血清GGT升高同时伴有ALP升高以肝外胆道梗阻、酒精性肝炎为显著。血清GGT在B组(急性肝炎)与C组(肝硬化、慢性肝炎)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:血清GGT可以作为肝外胆道梗阻、肝癌、酒精性肝炎、自身免疫性肝病诊断的一项敏感性指标。GGT与ALP同步明显升高应首先考虑肝外胆道梗阻、酒精性肝炎,其次是自身免疫性肝病、肝癌。在临床上GGT含量的检测对于不同肝胆疾病的鉴别诊断有一定的指导意义。

芹菜中6-磷酸甘露糖还原酶基因的克隆、进化和表达分析

以2个芹菜品种‘津南实芹’和‘美国西芹’为试材,采用RT-PCR技术分别获得6-磷酸甘露糖还原酶(M6PR)cDNA序列。序列分析表明:来源于2个芹菜品种的6-磷酸甘露糖还原酶基因核苷酸序列全长均为930 bp,编码309个氨基酸;预测其蛋白质相对分子质量为35×103,pI值为6.38。空间结构分析显示:M6PR蛋白由11个α-螺旋和13条β-延伸主链组成,中间形成1个疏水穴;催化四分体(Asp、Tyr、Lys和His)分布于疏水穴内部,具有催化活性。进化分析显示:芹菜M6PR与卷柏、小立碗藓、云杉等远古物种的醛-酮还原酶(AKR)相似性较高。实时定量PCR表达分析表明:M6PR基因主要在芹菜的茎中表达,具有明显的组织特异性。

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆与表达

谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase,GFAT)是己糖胺通路(HBP)的限速酶,参与几丁质的合成和蛋白质的糖基化。本研究利用RACE克隆了松墨天牛GFAT基因(Ma GFAT),Gen Bank登录号为KT362367,其长度为2624 bp,开放阅读框为2061 bp,编码686个氨基酸。序列对比分析显示Ma GFAT与赤拟谷盗相似性最高,为88%,在系统发育树上位于同一分支。采用RT-q PCR方法检测Ma GFAT在松墨天牛不同组织及不同发育时期的表达情况,结果表明:Ma GFAT在各虫态中,成虫中的表达量最高;在成虫部位中,翅的表达量最高;在幼虫各组织中,体壁的表达量最高。本文为研究GFAT结构与功能的关糸奠定基础,为阐明GFAT在松墨天牛几丁质合成中的作用提供参考。

老年股骨粗隆骨折患者γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、超敏C反应蛋白联合检测的临床意义

目的探讨老年股骨粗隆骨折患者γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)联合检测的临床意义。方法回顾性分析67例老年股骨粗隆骨折患者的GGT、ALP、hs-CRP水平,并研究术后不同时间点各指标相对于术前的变化情况及不同降低水平的预后情况。结果老年股骨粗隆骨折患者的GGT、ALP及hs-CRP水平高于健康对照者和其他部位骨折患者,且与病理参数有关;术后呈降低的趋势;老年股骨粗隆骨折患者中三项指标术后水平降幅较大者的Harris髋关节功能评分累积优良率高于降幅者低者,差异有统计学意义(P<0.01)。结论监测老年股骨粗隆骨折患者的血清GGT、ALP及hs-CRP水平及其术后的变化情况具有重要的临床意义。

在原发性肝癌患者检测碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶的意义

目的探讨血清甲胎蛋白、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶联合检测在原发性肝癌中检测的意义。方法对16例原发性肝癌、68例乙型肝炎肝硬化患者检测甲胎蛋白、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶并进行分析。结果原发性肝癌组患者血清ALP、GGT均值分别为(346.16±114.31)、(263.19±76.04),肝硬化组患者血清ALP、GGT均值分别为(114.25±55.28)、(49.25±11.36),原发性肝癌患者血清ALP、GGT明显高于肝硬化组。原发性肝癌组与肝硬化组的ALP和GGT相比较差异均有显著性,ALP(t=6.65,P<0.001)、GGT(t=29.03,P<0.001)。结论联合检测血清碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶和甲胎蛋白可使原发性肝癌总检出率达96%,也可提高原发性肝癌阳性检出率。

碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶对诊断肿瘤患者的应用

血清中碱性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰转移酶（GGT）可用于了解体内成份的变化。也可作为有关器官是否正常的特异性生化指标。近年来国外资料报道血清中该二酶可作为检测肿瘤患者的标志物。为了进一步探讨它们对恶性肿瘤诊断价值,笔者对105例肿瘤患者进行了此二种酶的测定,现将结果报告分析如下。

碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶在原发性肝癌检测的意义

目的探讨血清甲胎蛋白、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶联合检测在原发性肝癌中检测的意义。方法对46例原发性肝癌、40例肝硬化患者检测进行分析。结果原发性肝癌患者血清碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶明显高于肝硬化组。原发性肝癌组与肝硬化的碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶比较差异均有显著性。结论联合检测血清碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽和甲胎蛋白使原发性肝癌总检出率达96%,也可提高原发性肝癌阳性检出率。