γ-谷氨酰转肽酶高效表达及其催化合成γ-谷氨酰苯丙氨酸

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)可催化苦味氨基酸形成氨基酸衍生物,从而降低食物的苦味,在食品行业具有很好的应用前景。为了提高GGT表达量,基于NH+4,邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA),三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)与二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)之间的显色反应,建立一种用于获得GGT高表达量菌株的高通量筛选方法。易错PCR对HpaII-10区上游的7个碱基进行随机突变,筛选得到EF3HpaII突变体,使GGT表达量较原始启动子提高了63%。建立核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)文库,筛选得到RBS362,与EF3HpaII共同调控ggt表达,可使重组菌GGT表达量提高至60.25 U/mL,是原始菌的2.02倍。GGT催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe)合成γ-谷氨酰苯丙氨酸(γ-glutamylphenylalanine,γ-Glu-Phe),在最优条件下:底物浓度为50 mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine,L-Gln)和200 mmol/L L-Phe,酶浓度为1 U/mL,初始反应温度35℃,pH 10.0,γ-Glu-Phe最终产率高达94%。