茶氨酸生物合成工程菌构建

通过PCR扩增E.coliDH5α的γ-ggt基因,产物经纯化后用KpnI和XhoI双酶切,回收γ-谷氨酰转肽酶基因目的片断,并与经相同双酶切的表达载体pET-32a连接,得到重组质粒pET-GGT。将重组质粒转化到E.coliBL21中,获得工程菌。工程菌株经0.05mol/LIPTG,32℃诱导表达,湿菌体的酶活达到2.0U/g,大约是出发菌株E.coliDH5α的15倍。工程菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29.40g/L,L-Gln的转化率为48.22%,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coliDH5α提高了100多倍。

利用GS基因构建茶氨酸生物合成工程菌的研究

为了高效合成茶氨酸,本研究通过将荧光假单胞菌GS基因转接入pET32a质粒中,再将重组质粒转化到E.coli BL21中,构建了一种生物合成茶氨酸的基因工程菌。工程菌株经0.1mmol/LIPTG,28℃诱导表达,湿菌体的酶活达到41.79U/mg prot,大约是出发菌株E.coli BL21的126.64倍。工程菌催化L-谷氨酸钠和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到6.2g/L,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力较出发菌株E.coliBL21有显著提高。

催化合成茶氨酸的基因工程菌的构建及重组基因的表达

将大肠杆菌DH5α的GGT基因转接入pUC19质粒中后,再转入大肠杆菌菌液DH5α,构建了一种生物合成茶氨酸的基因工程菌。表达重组酶的最适养菌温度、最适诱导剂浓度及最适诱导温度分别为32℃、0.1mmol/L、32℃。工程菌株经IPTG诱导后,酶活大约是出发菌株DH5α的2.6倍,其催化谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到0.317 mg/ml,生物生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coliDH5α明显提高。