咖啡因抑制辐照区和旁区细胞的γ-H2AX foci的形成

辐射诱导的旁效应不仅在体外实验存在,也在动物体内存在,这对辐射剂量的计算和辐射风险的评估有重要影响。咖啡因是一个模式辐射敏感剂,显著增强辐射的细胞毒性。咖啡因也显著增强辐射诱导的旁效应,咖啡因处理使未受辐照的旁细胞对损伤信号更加敏感,但其机理并不清楚。在正常人原代细胞AG1522中,分析了咖啡因处理对组蛋白H2AX磷酸化的影响,咖啡因显著减少α粒子辐射区和旁区γ-H2AX foci阳性细胞的比率和每个细胞γ-H2AX foci点数,表明咖啡因处理抑制了H2AX磷酸化,后者启动细胞对DNA双链断裂的修复,从而提示咖啡因增强辐射旁效应可能的机理,对辐射治疗具有重要意义。

RUVBL2基因knock-down对Rad51和γ-H2AX foci的影响

用脂质体转染的方法将特定的RUVBL2 si RNA序列转染到真核细胞,并鉴定其在人肺纤维细胞(MRC5 SV)中的表达,以确保RUVBL2基因的knock-down效果。用Rad51和γ-H2AX的特异性抗体进行免疫荧光染色,应用荧光显微镜观察计数Rad51和γ-H2AX foci的数量。Western blot法证实了si RNA以及转染的效率,确定了RUVBL2基因的存在有利于诱导DNA双链断裂(DSB)条件下Rad51和γ-H2AX被招募到DNA损伤位点。

采用基于γ-H2AX焦点分析的流式细胞术检测纳米金颗粒的遗传毒性

目的:建立基于磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)生物标志物的流式细胞术遗传毒性检测方法,为纳米金颗粒的遗传毒性评价提供参考。方法:在加与不加体外代谢活化系统(S9)的条件下,分别设+S9短时处理组,选择终浓度为7.5、3.75和1.875μg/mL的环磷酰胺(CP)处理4 h;-S9长时处理组,选择终浓度为6.4、1.6和0.4μg/mL的依托泊苷(ETO)连续接触24 h,建立γ-H2AX生物标志物的流式细胞术检测方法。选择两种纳米金颗粒(样品1为溴化十六烷基三甲基溴化铵修饰,样品2为聚乙二醇修饰)作为实验材料,根据细胞毒性试验结果样品1和2分别选取3个不同浓度处理人成淋巴TK6细胞,分为+S9短时4 h组和-S9长时24 h组处理后收获细胞,采用γ-H2AX荧光抗体进行标记,流式细胞术分析γ-H2AX阳性细胞比例。同时设CP或ETO阳性对照和相应溶剂对照组。结果:与溶剂对照组相比,在有或无S9条件下,阳性对照组诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例显著增加(P<0.05),并存在剂量反应关系(CP:R2=0.837,P=0.01;ETO:R2=0.903,P<0.01),说明方法成功建立。在加与不加S9的条件下,两种纳米金样品各剂量组的γ-H2AX阳性细胞比例较溶剂对照组差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论:本实验建立了基于γ-H2AX焦点分析的流式细胞术遗传毒性检测方法,可用于纳米金颗粒的遗传毒性评价。

用流式细胞术检测γ射线诱发淋巴细胞γ-H2AX与照射剂量的关系

本研究使用流式细胞术检测了外周血淋巴细胞γ-H2AX表达水平,探讨了该方法用于辐射生物剂量估算的可能性。采集健康人外周血,进行体外60Coγ射线照射,利用γ-H2AX特异性抗体对淋巴细胞进行间接免疫荧光标记,采用流式细胞仪分析淋巴细胞中γ-H2AX的几何平均荧光强度值,并计算出相对荧光强度;比较了仪器类型和参数设定对上述两项指标的影响,以上述两项指标分别建立照射后30 min的剂量-效应曲线并进行对比。结果显示:参数设定和仪器类型均明显影响60Coγ射线照射后γ-H2AX几何平均荧光强度,而对相对荧光强度无显著影响。因此,用流式细胞仪分析γ-H2AX的相对荧光强度,较好地解决了实验的稳定性和重复性问题,有望成为一种估算辐射生物剂量的新方法。

电离辐射对Jurkat细胞γ-H2AX蛋白表达的影响

目的:探讨电离辐射诱导Jurkat细胞γ-H2AX蛋白表达的影响。方法:采用流式细胞术(FCM)分别检测2.0GyX线照射后不同时间点(0、0.5、1.0、4.0、8.0、16.0及24.0h)和0.5、1.0、2.0、4.0及6.0Gy不同剂量X线照射后Jurkat细胞γ-H2AX表达变化,并于量效实验同时进行Jurkat细胞凋亡率检测。结果:与假照组比较,2.0GyX线照射后Jurkat细胞γ-H2AX表达水平于1.0h内达最大值,1.0h后开始呈时间依赖性下降,16.0h仍高于假照水平(P<0.01),24.0h降至与对照无明显差异;不同剂量X线照射后1.0h,Jurkat细胞γ-H2AX的表达水平在0.5Gy以内没有明显变化,0.5Gy以后呈剂量依赖性升高,4.0Gy时达最高水平(P<0.01),6.0Gy时表达略下降;不同剂量X线照射后8.0h,γ-H2AX表达在0～4.0Gy范围内随剂量增大而逐渐升高,4.0Gy时达到最高水平(P<0.01),6.0Gy时表达有所下降。结论:X射线能诱导Jurkat细胞γ-H2AX表达增高,在一定范围内存在时间和剂量依赖关系。

γ-H2AX免疫荧光分析技术评估CT辐射损伤的临床研究

目的:比较双源CT前瞻性心电门控大螺距扫描方式与回顾性心电门控小螺距扫描方式的辐射剂量及其电离辐射对人外周血淋巴细胞内DNA的损伤情况,并探索γ-H2AX作为低剂量X线电离辐射损伤生物剂量计的可行性及应用前景。方法:将40例拟行冠状动脉CTA的患者按扫描前的心率分为两组:大螺距组18例,心率<70次/分,螺距3.4,FLASH序列,前瞻性心电门控;小螺距组22例,心率≥70次/分,螺距0.20~0.33,回顾性心电门控。两组均采用智能CARE-kV结合CARE Dose4D调节技术自动选取最优管电压及管电流。于CT检查前及检查后30min每例患者抽取静脉血4mL,采用γ-H2AX免疫荧光分析法检测淋巴细胞DNA双链断裂(DSBs)情况(γ-H2AX荧光点与淋巴细胞计数的比值,记为R_(焦点/细胞))。采用两组独立样本t检验比较两组间BMI及CT检查前后R_(焦点/细胞)的差异,采用Mann-Whitney U检验比较两组间检查前后R_(焦点/细胞)差值(△R)和辐射剂量指标(CTDIvol、DLP、ED)的差异,采用Spearman等级相关法分析DLP与△R的相关性。结果:两组患者的年龄、性别构成比及体质指数(BMI)的差异无统计学意义(P>0.05)。大螺距组的CTDIvol、DLP和ED值分别为(12.29±1.68)mGy、(100.28±30.60)mGy·cm和(1.41±0.43)mSv,3个指标的均值明显低于小螺距组[分别为(39.11±10.75)mGy、(537.27±152.74)mGy·cm和(7.52±2.14)mSv],组间差异均有统计学意义(P<0.05)]。40例患者CT检查前、后的R_(焦点/细胞)分别为(0.137±0.036)和(0.244±0.072),CT检查后检查者淋巴细胞内DSBs数量明显增多(t=10.294,P=0.000)。大螺距组和小螺距组的△R分别为(0.058±0.034)和(0.148±0.058),小螺距组高于大螺距组(U=27.50,P=0.000)。仅小螺距组的DLP与△R之间存在等级线性相关关系(r=0.781,P=0.000)。结论:前瞻性心电门控大螺距FLASH扫描方式的辐射剂量及电离辐射引起的DSBs明显低于回顾性心电门控小螺距扫描方式,而两组图像质量均能满足诊断要求;γ-H2AX监测可较准确地反映低剂量X线辐射损伤,应用前景广。

γ-H2AX与DNA双链断裂关系的研究进展

H2AX是组蛋白的一个种类,普遍存在于整个基因组中。据报道,DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸-139位C-端保守区域内的H2AX磷酸化形成γ-H2AX,在荧光显微镜下形成可见的γ-H2AX焦点。用特异性抗体的免疫荧光法检测γ-H2AX已成为测定DSB的金标准。目前,多种物理性、化学性和生物性的因素都能诱导形成γ-H2AX焦点。本文综述了不同因素诱导形成γ-H2AX的机制及其与DNA双链断裂之间的关系的研究进展。

流式细胞仪检测电离辐射与γ-H2AX剂量效应关系的方法研究

目的比较3种不同的固定和标记方法在流式细胞仪检测电离辐射与磷酸化H2AX(γ-H2AX)的剂量反应关系上的差异。方法用137Cs源分5个剂量点(0、1、2、4、8Gy)照射人乳腺癌细胞(MCF-7),分别用70%乙醇双标、70%乙醇单标和2%多聚甲醛单标MCF-7细胞,应用流式细胞仪检测电离辐射与γ-H2AX剂量效应关系。结果3种方法均发现电离辐射与γ-H2AX水平存在剂量反应关系,即γ-H2AX水平随着电离辐射剂量的增加而增加。拟合剂量反应曲线符合直线方程。乙醇固定双标法的决定系数最大,为0.87。结论应用流式细胞仪乙醇固定双标法检测MCF-7细胞电离辐射与γ-H2AX剂量效应关系,优于乙醇或多聚甲醛单标法。

轻型地中海贫血成年男性精液质量及其精子γ-H2AX含量的研究

目的研究轻型地中海贫血成年男性精液质量,探讨精子γ-H2AX含量及其与精液参数、血清铁蛋白浓度的关系。方法选取轻型地中海贫血的成年男性100例(轻型地中海贫血组)和确认有生育能力的健康男性100例(对照组)。通过检测精子γ-H2AX含量、精子DNA损伤率、血清铁蛋白浓度、精浆活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)及精液常规参数,分析两组间差异及轻型地中海贫血组精子γ-H2AX与精液参数、血清铁蛋白浓度的相关性。结果相比对照组,轻型地中海贫血组的精子γ-H2AX表达率、精浆ROS、DNA损伤率及血清铁蛋白浓度显著增高(P<0.001),而精子浓度、精子前向活动力及精子正常形态百分率显著降低(P<0.001);精子γ-H2AX表达率与精子DNA损伤率、精浆ROS水平、血清铁蛋白浓度呈正相关(P<0.001),而与精子前向活动力、精子正常形态百分率呈负相关(P<0.001)。结论轻型地中海贫血成年男性的精液质量较健康男性差,γ-H2AX含量明显高于健康男性,这可能与铁负荷增加所导致的精子DNA损伤率升高有关。

免疫磁珠对紫外线引起CD4细胞γ-H2AX相对荧光强度变化的影响

针对免疫磁珠技术中磁珠大小对免疫检测结果的影响问题,以三种免疫磁珠为研究对象,分析了单个细胞结合不同大小磁珠的数量情况,利用流式细胞术分析了γ-H2AX相对荧光强度变化与辐射剂量的变化关系,探讨了免疫磁珠与细胞结合对紫外线UVC诱发CD4细胞γ-H2AX相对荧光强度变化的影响。发现细胞与磁珠比为1∶10时单个细胞至少可以结合一个磁珠,结合数量与磁珠大小有关;UVC辐照引起CD4细胞γ-H2AX相对荧光强度变化与辐射剂量呈线性正相关,小磁珠(50 nm)和中磁珠(2.8μm)与细胞结合γ-H2AX荧光强度与辐射剂量之间仍具有一定的剂量效应关系,但大磁珠(4.5μm)与细胞结合会导致γ-H2AX相对荧光强度与辐射剂量的线性关系不明显。结果可为今后将免疫磁珠用于辐射诱导的DNA损伤评估奠定基础。

调控靶向Xklp2表达对肺鳞癌细胞放射线照射后γ-H2AX蛋白表达的影响

目的探讨调控靶向Xklp2(TPX2)表达对肺鳞癌细胞放射线照射后γ-H2AX蛋白表达及细胞核内γ-H2AX和MDC1斑点形成的影响。方法利用前期构建的稳定转染TPX2 shRNA质粒的SK-MES-1细胞和稳定转染TPX2过表达质粒的NCI-H226细胞,采用Western印迹检测4 Gy照射后0～24 hγ-H2AX蛋白表达,免疫荧光技术观察4 Gy照射后4 h细胞核内γ-H2AX和MDC1斑点形成情况。结果 4 Gy照射后0～24 h,TPX2干扰的SK-MES-1细胞和TPX2过表达的NCI-H226细胞中γ-H2AX蛋白表达水平均出现显著增加后逐渐下降的趋势,但在TPX2干扰的细胞中,各时间点γ-H2AX蛋白表达水平均显著高于单纯照射组(P<0. 05),而在TPX2过表达细胞中,各时间点γ-H2AX蛋白表达水平均显著低于单纯照射组。②照射后4 h,下调TPX2表达则γ-H2AX和MDC1核内斑点形成增加,而过表达TPX2则γ-H2AX和MDC1核内斑点增加幅度降低(P<0. 05)。结论照射后H2AX磷酸化及γ-H2AX和MDC1核内斑点形成变化,提示TPX2参与DNA损伤修复。

比较碱性彗星试验与γ-H2AX法评价甲醛诱导的DNA交联

DNA交联是环境诱变剂和化学致癌物诱发的遗传物质损伤之一,主要包括DNA-蛋白质交联(DNA-protein crosslink,DPC)和DNA-DNA交联(DNA-DNA crosslink,DDC)两类^[1]。DNA交联的形成可导致DNA复制过程中重要基因的丢失,从而造成染色体缺失、重排、转位、倒置等染色体结构和数目的畸变,对子代细胞的遗传物质产生影响,严重时可导致肿瘤或子代畸形^[2]。DNA交联与断裂相比难于修复或易于形成错误修复,且在细胞周期中可维持较长一段时间。故世界卫生组织(WHO)提出DNA交联可作为DNA损伤的生物标志物,用于对化合物或环境因素的潜在遗传毒性进行筛查^[3]。常见的可导致DNA交联的药物或因素包括甲醛、顺铂、环磷酰胺、丝裂霉素、油烟、氧化型染发剂、电离辐射等。

电离辐射生物标志物γ-H2AX的检测技术研究进展

电离辐射可导致DNA双链断裂,从而使组蛋白H2AX迅速在双链断裂处磷酸化为γ-H2AX。检测细胞中γ-H2AX聚集处形成的焦点数目可用于评价DNA双链断裂情况,且与辐射剂量相关。因此,γ-H2AX可作为电离辐射的生物标志物,用来评价电离辐射的致突变能力,亦可作为电离辐射生物剂量计,用于估算个体受照剂量。γ-H2AX检测技术在辐射生物学研究、辐射分子流行病学调查,以及辐射事故应急响应与医学处置等方面具有重要应用价值。本文将重点阐述近十年来国内外基于电离辐射生物标志物γ-H2AX的检测方法研究进展和应用前景。

p53和γ-H2AX作为乙醛引起DNA损伤早期生物标记物的实验研究

目的：评价乙醛染毒p53野生型人类淋巴母细胞（TK6）后，细胞中DNA损伤标记物p53、γ-H2AX的表达变化，并与彗星试验中的DNA链断裂指标进行敏感性比较，探讨p53和γ-H2AX作为乙醛引起DNA损伤的早期生物标记物的可能。方法：乙醛在0.5～20 mmol/L的浓度范围分别染毒TK6细胞20 min、2和12 h后，采用高通量的流式细胞术检测肿瘤抑制蛋白total-p53、磷酸化p53（p-p53）以及磷酸化组蛋白（γ-H2AX）的细胞表达率和表达强度（平均荧光强度）；同时采用碱性彗星试验检测乙醛引起的DNA链断裂指标（细胞拖尾率、尾长、尾部DNA百分含量以及尾矩）的变化。结果：乙醛染毒TK6细胞12 h后，γ-H2AX的表达强度在15及20 mmol/L浓度下显著升高（P〈0.05），p-p53的细胞表达率在0.5～7.5 mmol/L浓度范围内呈现剂量依赖的升高趋势，total-p53的细胞表达率趋势与p-p53相似，但与阴性对照组相比，差异无统计学意义。彗星试验中，细胞拖尾率、尾长、尾部DNA百分含量以及尾矩在5.0～12.5 mmol/L浓度范围内均增加，并呈现剂量依赖性。染毒2 h后，与阴性对照组相比，total-p53和p-p53的细胞表达率在15和20 mmol/L浓度下显著升高（P均〈0.05），细胞拖尾率、尾部DNA百分含量以及尾矩在20 mmol/L浓度升高（P均〈0.05）。染毒20 min后，3种生物标志物均未见清晰的变化趋势，4种DNA链断裂指标均未见显著变化（P均＞0.05）。结论：乙醛染毒TK6细胞12 h可诱导p-p53细胞表达率升高、γ-H2AX细胞表达强度升高、total-p53细胞表达率轻微升高，以及细胞拖尾率、尾长、尾部DNA百分含量、尾矩的升高。p-p53比γ-H2AX和DNA链断裂指标在检测乙醛诱导的DNA损伤方面更加敏感。

牛乳骨桥蛋白诱导破骨细胞γ-H2AX焦点的形成

文章探讨了牛乳骨桥蛋白(bovine Osteopontin,bOPN)是否可引起大鼠破骨细胞(Osteoclasts,OC)γ-H2AX焦点的形成的可能性。采用全骨髓培养法培养破骨细胞,用bOPN处理破骨细胞,MTT比色法测定bOPN对破骨细胞的增殖影响,应用免疫荧光试验检测细胞核内DNA双链断裂(γ-H2AX焦点)的形成。在细胞增殖实验中,bOPN 100μg.mL-1浓度组在24 h较对照组差异显著(P<0.05);100μg.mL-1浓度组在72 h较对照组差异极显著(P<0.01);在免疫荧光试验中,1、10、100和1 000μg.mL-1处理组都可以使OC形成焦点,尤其1 000μg.mL-1处理组时数量虽不多,强度却明显增加。总之bOPN可使H2AX磷酸化,进而诱导γ-H2AX焦点的形成。

DNA损伤标志物γ-H2AX及其在毒性测试应用中的研究进展

当DNA受到攻击尤其是发生DNA双链断裂(DSB)后,组蛋白H2AX的139位丝氨酸迅速磷酸化,生成磷酸化H2AX即γ-H2AX。γ-H2AX在DSB位点大量聚集并形成焦点,参与DNA的损伤修复,且γ-H2AX焦点数与DSB数量成正比。目前研究表明,γ-H2AX是表征DNA损伤的特异性生物标志物,可作为基因毒性的特异性效应指标。旨在检测γ-H2AX的试验(简称γ-H2AX试验)已被应用于众多与DNA损伤相关的基础研究和医学诊断中。本文介绍γ-H2AX的生成及生物学意义,论述基于免疫化学技术及质谱技术的γ-H2AX试验在体外基因毒性评价中的应用、γ-H2AX试验与其他基因毒性试验的性能对比及γ-H2AX与其他毒性终点标志物的互补性,并对γ-H2AX试验在基因毒性风险评估中的应用前景予以展望。

基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法的建立

目的:建立基于流式细胞术的生物标记物γ-H2AX自动化检测方法,并探讨此方法用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的前景。方法:试验分为不添加体外代谢活化系统(-S9)长时(24 h)处理组和添加体外代谢活化系统(+S9)短时(4 h)处理组,分别采用CCK-8方法选择4个不同浓度的依托泊苷(ETO)和环磷酰胺(CP)处理人成淋巴TK6细胞,24 h后收获细胞,采用连接荧光分子的γ-H2AX抗体和核酸染料SYTOX Green双色标记,使用高通量流式细胞仪分析组蛋白H2AX磷酸化(γ-H2AX)阳性的细胞比例。结果:与溶剂对照组比较,-S9 24 h处理组,不同浓度的依托泊苷诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例显著增加,量效关系明显(r=0.999,P<0.05);+S9 4 h处理组,不同浓度的环磷酰胺诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例亦显著增加,量效关系明显(r=0.988,P<0.05)。结论:流式细胞仪可快速、准确地分析体外培养的TK6细胞中γ-H2AX的变化,本试验初步建立了基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法。

γ-H2AX识别抗体免疫荧光法:一种检测DNA双链断裂的新方法

-γH2AX识别抗体免疫荧光法是检测电离辐射致DNA双链断裂的一项新技术,也是进行DNA损伤修复、细胞周期调节点等研究的一个重要工具。本文综述了该方法的基本原理、分析程序和影响因素,分析了方法的优缺点和应用前景。

组蛋白H2AX与DNA损伤的分子感应

DNA双链断裂是电离辐射对DNA的重要损伤类型,与细胞死亡、基因突变甚至细胞恶性转化有密切联系。DNA发生双链断裂后最早反应之一是位于断裂点附近的组蛋白H2AX的C末端丝氨酸残基发生磷酸化,形成γ-H2AX。磷酸化的γ-H2AX快速转导DNA损伤信号,导致下游分子磷酸化的激活,引发一系列的生物级联反应和和细胞学反应。γ-H2AX是迄今所研究的最重要的DNA损伤感应分子。

重离子所致DNA双链断裂损伤修复的γH2AX焦点响应

DNA双链断裂(DSB)是电离辐射所致基因组DNA的主要和最严重的损伤类型,磷酸化组蛋白γH2AX能比较特异地在DSB处形成焦点,是DSB的分子标志物之一。比较了重离子~7Li、^(12)C与γ射线辐照小鼠MEF细胞诱发γH2AX焦点的规律特征。结果显示,诱发形成的平均每个细胞的γH2AX焦点数目与照后时间相关,表达峰值出现在照后2 h,但不同类型辐射高表达的持续时间不同。在相同剂量下,致焦点形成率与辐射的LET值相关,LET值越高,形成率越大。γ射线诱发的γH2AX焦点尺寸随照后时间无明显变化,高LET重离子诱发的γH2AX焦点尺寸随时间变化先增加后减小;与低LET的γ射线相比,高LET辐射诱发的焦点平均尺寸明显变大,LET越高焦点尺寸越大且保持时间越长。