γ-PGA降解酶系基因pgdS和ggt的克隆及生物信息分析

以实验菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 115基因组为模板,通过PCR技术成功克隆到γ-聚谷氨酸降解酶系基因pgd S和ggt,并进行测序,利用Ex PASy-Prot Param tool、Server 3.0 Signal P、TMHMM Server和Tmpred、PSORTB、Predict Protein、Swiss-Model Workspace软件,分别对蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、二级结构、三维结构建模进行了分析和预测。结果表明:pgd S和ggt基因分别含1242个和1764个核苷酸,分别编码414个和588个氨基酸。Pgd S和GGT均为稳定型亲水性蛋白,都存在信号肽,其亚细胞分别定位于胞壁和胞外。GGT在N端存在一个强跨膜区。二级结构分析显示,Pgd S和GGT两种蛋白都以L(环)为主,分别占53.27%和52.47%。通过对γ-PGA降解酶系蛋白结构的分析,为日后有效控制γ-PGA合成及相关研究提供参考和理论依据。

响应面法对Bacillus natto TK-2产聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)发酵培养基的优化

通过Plackett-Burman设计和响应面分析对B.natto TK-2发酵产γ-PGA的培养基进行了优化。首先通过Plackett-Burman设计从6个因素中筛选出了有显著影响的葡萄糖、味精、CaCl_2等3个因素;然后通过最陡爬坡和Box-Behnken设计进一步优化,并利用SAS软件进行回归分析,得到以上3个因素的最佳浓度分别为(g/ L):葡萄糖21.4,味精25.1,CaCl_2 2.6。在优化后的培养基下,γ-PGA的产量比优化前提高了34.01%。

微生物聚谷氨酸(γ-PGA)合成酶及合成机理的研究进展

γ-PGA是一种可降解的、水溶性的,对人体无毒的生物高分子。目前发现多种微生物能合成γ-PGA,包括芽孢杆菌、古生菌和一种真核生物。γ-PGA合成基因可分为capB、capC、capA、capE和pgsB、pgsC、pgsA和pgsE,其表达产物组成的γ-PGA合成酶复合体与细胞膜结合,并消耗ATP及底物谷氨酸进而合成γ-PGA,其中CapB-CapC(或者PgsB-PgsC)主要负责γ-PGA的聚合作用,而CapA-CapE(或者PgsA-PgsE)则作用于γ-PGA的转运。ComP-ComA、DegS-DegU、DegQ、SwrA和pgsB上游的非编码区则对pgsB、C、A和E的表达起重要影响。

复混肥中聚谷氨酸(γ-PGA)稳定性及其对肥料物理性质的影响

应用γ-PGA制剂(固体含γ-PGA8%,液体含γ-PGA3.5%),以圆盘造粒、掺混包裹两种结合方式生产不同γ-PGA浓度的复混肥,在肥料生产当日及存放30天,90天,180天分别测定肥料中γ-PGA含量及其物理性质,探讨复混肥中γ-PGA的稳定性及γ-PGA对肥料物理性状的影响。结果表明,不同时段复混肥中γ-PGA含量相对稳定,但因不同加工工艺过程导致γ-PGA的检出率存在较大差异,其中,采用包裹肥料方式,检出率明显较高。γ-PGA对复混肥物理性状也有一定影响,采用造粒方式含γ-PGA复混肥无粉尘、无结块等现象,采用包裹方式含γ-PGA复混肥虽存在少量粉尘、结块等问题,但不至于影响肥料中γ-PGA含量,说明生产含γ-PGA复混肥以包裹方式相对较好。

高产γ-PGA菌株的分离筛选与菌种初步鉴定

从高温处理过的腐乳和豆豉中分离到一系列单菌落,通过不同的培养基初筛、复筛,得到一株高产-γPGA的菌株N6,根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版,对N6进行了形态和生理生化特征的分析,以及对产物进行了红外光谱法测定,初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

无机盐混合试剂与γ-PGA复合处理对早稻苗期耐冷性的引发和分子效应分析

以冷敏感早稻品种华矮21为材料,利用CaCl2、无机盐混合试剂、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)分别与γ-PGA组合引发水稻种子36 h,研究了在水培条件下生长7 d的水稻幼苗在6℃低温处理2 d和常温恢复生长3 d的生长表现和生理特性。结果表明,在低温胁迫下,不同复合引发剂引发处理水稻种子可以提高幼苗的耐冷性,可溶性糖增加,MDA含量降低,APX和SOD酶活性明显增强。综合生长与生理指标的表现可以看出,无机盐混合试剂与γ-PGA复合引发处理的效果最好。利用RT-PCR方法检测6个低温响应基因经此复合引发处理后的水稻幼苗在受低温处理后转录水平变化。结果表明,在低温胁迫下,OsICE1基因转录水平无变化,其他5个低温响应基因的转录明显增强,其中OsDREB1B和OsCDPK7基因受无机盐混合试剂与γ-PGA复合引发处理的诱导表达,OsMYBS3和OsFAE2基因表达不受种子引发处理的影响,OsLIP19基因的表达受到了一定程度的抑制。这揭示无机盐混合试剂与γ-PGA复合引发处理可能通过增强水稻低温信号传导转录途径ICE1-DREB1B的表达而提高水稻的耐冷性。这些结果为复合型γ-PGA种子引发处理在提高早稻耐冷性中的应用提供了理论依据。

高分子聚合物γ-PGA对长双歧杆菌的冻干保护作用

以长双歧杆菌为实验菌株,以高分子聚合物γ-PGA为主要保护剂进行冻干实验。通过对冻干菌粉的存活率、发酵产酸能力,冻干菌粉和反复冻融3次后菌体形态的微观变化进行研究。结果表明:用10%脱脂乳粉作为保护剂菌体存活率为47.3%,以2.5%γ-PGA为保护剂菌体存活率为54.8%。以10%脱脂乳粉和1.5%γ-PGA作为保护剂其存活率为79.8%,复合保护剂比10%脱脂乳粉单一保护剂存活率高25.0%左右。电镜观察采用复合保护剂菌体外层形态呈致密包裹结构,冻融3次后菌体形态完整,细胞结构未见严重损伤和变形,复水后作为菌种进行发酵,18 h时的酸度达到65.5°T,室温贮藏90 d存活率仍能达到48.7%。

产γ-PGA菌种选育及固态培养条件的优化

从纳豆中分离筛选一株产γ-PGA菌株SK-1,以大豆为培养基固态发酵生产γ-聚谷氨酸,紫外、红外光谱扫描所提产物,结果与对照标准品图谱基本一致。通过正交试验对固体培养条件进行优化,得到γ-PGA固态发酵最佳条件:温度35℃,时间24h,装填量50g/250mL,接种量5%.产物提取条件试验表明:添加不同比例乙醇对γ-PGA产量基本无影响,提取时无需调节浸提液pH。

以玉米为原料产γ-PGA的研究

通过摇瓶补料分批发酵方式下对γ-多聚谷氨酸产量影响的研究,最终确定了玉米糖化液、蛋白胨和前体物谷氨酸钠的最优初始浓度和最优补料方式,食用味精作为前体物。实验结果显示了,最优初始玉米糖化液浓度为20g/L,最优初始蛋白胨浓度为3g/L,最优初始前体物谷氨酸钠0g/L。进行全组分补料使γ-多聚谷氨酸产量达到76.56gLg/L。

纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)固体发酵生产γ-PGA

γ 多聚谷氨酸是一种生物可降解的高分子材料 ,可应用于许多领域 ,因此受到普遍的重视。目前γ PGA液体发酵水平为 5 0～ 60g L。报告了用大豆固体发酵生产γ PGA的方法 ,其中包括 :菌种的筛选 ,发酵和提纯方法 ,高压液相法测定含量和SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果 :BacillussubtilisnattoHW_1发酵活性为 1 1 5g kg大豆。γ_PGA的纯度为 95 %以上 ,分子质量为31 6kDa。另外可在大豆固体发酵生产纳豆激酶的同时生产回收γ PGA ,既可以降低产品成本 ,又可以开发应用γ PGA。

新型高效吸水材料(γ-PGA)的农业应用研究初报

对由南京化工大学制药与生命科学学院新研制的生物聚合高效吸水材料——γ-聚谷氨酸(γ-PGA)在农业上的应用前景进行了初步研究。试验结果表明,γ-PGA两次重复的平均吸水率可达到1108.4倍,比目前市售的聚丙烯酸盐类吸水树脂高2.85倍。γ-PGA对土壤水分的吸收率为30～80倍。γ-PGA的水浸液在土壤中有较强的保水力和较理想的释放效果,具有明显的抗旱促苗效应。用不同浓度PEG(6000)试剂(聚乙二醇)模拟土壤吸水力的种子发芽试验表明,γ-PGA有较强的吸水和保水能力,可明显提高小麦和玉米的发芽率。γ-PGA的直接拌种试验和γ-PGA水浸液的鲜切花保鲜试验对提高植物种子发芽率和延长保鲜期都有显著效果。为进一步发挥γ-PGA在农业上的应用价值,需要进一步开展植物—土壤—γ-PGA的水分平衡模型研究。

纳豆中γ-PGA的分离纯化和鉴定

采用野生和诱变的纳豆枯草芽孢杆菌菌株,经固体发酵生产γ-PGA,比较了得率和纯度的差异。通过乙醇沉淀、离心和真空冷冻干燥方法对γ-PGA进行分离纯化,并采用薄层层析的方法鉴定,选择不同分配剂的配比和不同的载体,获得了最佳层析步骤。

γ-PGA处理电镀废水最佳反应条件的研究

γ-PGA(γ-聚谷氨酸)是近年发展起来的一种新型生物高分子功能材料。γ-PGA作为一种生物絮凝剂处理电镀生化出水,需要一个最佳的反应条件。通过单因素实验得知最佳的反应条件为:pH在9.0左右,γ-PGA投加量为1 mg/L,反应温度为30℃。最后利用Zeta电位对测定单因素实验得出的结果进行验证。在最佳的反应条件下,可以通过γ-PGA的处理降低电镀废水中的重金属离子,使电镀废水能够满足达标排放的标准。

γ-PGA在‘灵武长枣’栽培中的应用效果研究

为探明γ-聚谷氨酸(γ-PGA)不同施用方式对‘灵武长枣’生长的综合影响,以宁夏灵武市千亩果业设施基地大棚的2年生盆栽‘灵武长枣’幼树为试验对象,采用不同浓度梯度的γ-PGA对‘灵武长枣’进行叶面喷施和灌根处理,通过测定‘灵武长枣’新梢长、叶面积、叶绿素含量等指标,研究了灌根和叶面喷施2种处理下不同浓度梯度的γ-PGA对‘灵武长枣’生长及叶绿素含量的影响。结果表明:灌根处理下,200 mg·L^(-1)PGA对‘灵武长枣’新梢长、新梢粗、叶面积、叶绿素的含量具有显著的促进作用;叶面喷施处理下,300 mg·L^(-1)PGA对‘灵武长枣’新梢长、枣吊长、枣吊粗、叶面积具有显著的促进作用,而200 mg·L^(-1)PGA对‘灵武长枣’新梢粗起抑制作用;灌根和叶面喷施不同浓度的PGA后均对叶片厚度无显著影响。综上,2种施肥方式下,合理的PGA浓度均能促进‘灵武长枣’幼苗的生长,其中灌根处理下PGA的最适浓度为200 mg·L^(-1),叶面喷施处理下PGA的最适浓度为300 mg·L^(-1)。因此,在宁夏地区长枣幼树实际栽培过程中,要科学合理地使用2种施肥方式。

产聚γ-PGA菌株分离与产物鉴定

从豆酱中分离筛选一株产聚γ-PGA的菌株SK-3,依据菌落的外观形态、菌体镜下形态及其部分生理生化特性,初步鉴定菌株为枯草芽孢杆菌。该菌株固态发酵大豆所提产物经紫外光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描,结果显示与聚γ-PGA标准品的图谱基本一致,说明产物归属于聚酰胺类化合物;所提产物水解后经纸上层析法检测,仅为单一氨基酸——谷氨酸,说明产物是谷氨酸聚合物。

NaCl、Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸对地衣芽孢杆菌WBL-3合成新型土壤修复材料γ-PGA的影响

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)及其衍生物是一种新型土壤修复和改良材料,能吸附土壤中的重金属和放射性核物质等污染物,也可作为保水材料应用于干旱环境。NaCl、Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸四因素对Bacillus licheniformisWBL-3合成γ-PGA产量及分子量有重要影响。分别用L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸代替L-谷氨酸,Bacillus licheniformisWBL-3未产生γ-PGA。单因素试验表明:γ-PGA产量均随四因素浓度的增大呈现先增大后减小的趋势,γ-PGA产量分别在NaCl,Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸浓度为6%,100μmol.L-1,1.5 mmol.L-1和10 mmol.L-1时达到最大值35.79g.L-1,24.77 g.L-1,30.07 g.L-1和26.09 g.L-1;γ-PGA分子量随NaCl浓度的增大而增大,随α-酮戊二酸浓度的增大而减小,随Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺浓度的增大而呈现先增大后减小的趋势。正交试验证明了单因素试验的结论,四因素间没有交互作用的影响,最优组合为NaCl:6%,α-酮戊二酸:10 mmol.L-1,Mn(Ⅱ):100μmol.L-1,L-谷氨酰胺:1.5 mmol.L-1,产量达到55.62 g.L-1。

一株产γ-PGA的芽孢杆菌的分离鉴定及发酵条件的优化

目的:筛选一株高产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的菌株,并优化其发酵条件。方法:从豆腐作坊周边土地取样,采用平板稀释涂布法,筛选高产γ-PGA的菌株,通过菌落形态、分子生物学方法对其进行鉴定;以γ-PGA产量为响应值,在单因素实验的基础上,以温度、pH、转速、底物浓度为实验因素,采用Box-Behnken法设计四因素三水平试验进行响应面优化,确定其产γ-PGA最佳发酵条件。结果:筛选获得一株高产γ-PGA的芽孢杆菌B-6578,鉴定为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis);通过单因素和响应面最终获得该芽孢杆菌发酵产γ-PGA的最佳条件为:温度37.5℃,pH7.48,转速240 r/min,底物浓度52.70 g/L,摇瓶发酵36 h,γ-PGA的产量达到24.82 g/L,γ-PGA转化率为47.10%,比优化前提高了25.19%。结论:采用响应面法优化得到的发酵条件方便可行,利于γ-PGA的进一步开发利用。

基于ATR-FTIR光谱的γ-PGA发酵批次分类研究

利用衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)技术对聚谷氨酸(γ-PGA)发酵批次进行快速识别检测.根据5个批次的γ-PGA发酵液光谱建立了5个偏最小二乘判别分析(PLSDA)分类模型来鉴别每一批次与其他批次,在某些局部评价指标(准确率)上取得了不错的结果.为了提高模型在全体指标(如准确率、精度、灵敏度等)上的整体效果和模型的可解释性,采用子窗口置换分析(SPA)、竞争自适应重加权采样(CARS)以及随机青蛙(RF)三种波数选择算法结合PLSDA提取特征波数,建立PLSDA判别模型.实验结果表明,经波数选择(除CARS)后,PLSDA在各个批次上的各项性能指标均得到提升,而且模型复杂度降低,可解释性增强;ATR-FTIR技术结合SPA-PLSDA或RF-PLSDA方法可实现对γ-PGA发酵批次的快速识别.

一种富含γ-聚谷氨酸的发酵饲料对蛋鸡产蛋后期生产性能、蛋品质、血清生化指标及脂代谢的影响

为研究基础饲粮中添加不同比例富含γ-PGA的发酵饲料,对蛋鸡产蛋后期生产性能、蛋品质、血清生化指标和脂代谢的影响,试验选取71周龄的京红3号蛋鸡240只,随机分为4组,每组4个重复,每个重复15只鸡。对照组饲喂基础饲粮,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别添加0.5%、2%和8%富含γ-PGA的发酵饲料替代部分基础饲粮。预试期7 d,正试期28 d。结果表明:(1)与对照组相比,各试验组的平均蛋重增加,但差异不显著(P>0.05),破损+畸形蛋率下降,其中Ⅰ组较对照组下降52.6%(P<0.01);(2)各试验组的蛋黄颜色和蛋壳强度有增加趋势(P>0.05),Ⅰ组蛋黄丙二醛含量较对照组降低41.5%(P<0.01);(3)各试验组总蛋白、球蛋白和磷含量有增加趋势,但差异不显著(P>0.05),Ⅰ、Ⅱ组血清中钙含量分别较对照组下降16.5%、22.9%(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组葡萄糖含量较对照组分别下降36.6%、19.1%和17.4%(P<0.01),尿酸含量与对照无显著差异(P>0.05);(4)各试验组蛋鸡血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平下降,HDL-C含量升高,其中Ⅰ组T-CHO和TG分别下降34.4%和30.9%(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ组HDL-C含量分别是对照组的5.13倍和9.31倍(P<0.05)。由此可见,产蛋后期蛋鸡的饲粮中加入适量的富含γ-PGA发酵饲料,可以增加平均蛋重、蛋黄颜色、蛋壳强度及血清中的磷含量,降低破损+畸形蛋率、蛋黄丙二醛和血清葡萄糖的含量,控制蛋鸡血清脂代谢,使血清甘油三酯和胆固醇维持在正常水平。因此,富含γ-PGA的发酵饲料具有作为饲料添加剂用于蛋鸡的潜力,且0.5%的添加量效果最佳。

水溶肥中添加不同增效剂对青梗菜生长的影响

为验证大量元素水溶肥添加新型肥料增效剂的效果,以青梗菜为试材,通过对青梗菜农艺性状和产量的测定,探究大量元素水溶肥中添加聚谷氨酸(γ-PGA)、γ-氨基丁酸(GABA)对青梗菜生长的影响。结果表明,在大量元素水溶肥(20-20-20)中添加γ-PGA、GABA增效物质均能改善青梗菜的农艺性状和提高产量,以添加0.2‰γ-PGA和1‰GABA时促生效果最好,其与仅施大量元素水溶肥(20-20-20)相比,青梗菜SPAD值提高9.60%,叶片数增加13.59%,最大叶面积增加33.43%,单株产量增加15.05%。本研究结果可为后期新型肥料的推广应用提供参考。