^(A)γ-珠蛋白基因启动子区域-114~-102缺失突变导致非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征的研究

目的:研究^(A)γ-珠蛋白基因启动子区域-114~-102缺失突变病例的基因突变特点、血液学表型及临床表型。方法:选取2022年3月至2023年12月在广西医科大学第一附属医院检查地中海贫血的病例4例。血红蛋白(Hb)分析仪和血细胞分析仪检测全血样本,分析Hb和血常规。Sanger测序法与荧光PCR熔解曲线法检测γ-珠蛋白基因启动子区突变和β-珠蛋白基因突变。结果:共检出^(A)γ-114~-102缺失杂合子4例,Hb分析显示血红蛋白F(Hb F)水平为11.2%~37.8%,血红蛋白A2(Hb A2)水平为2.0%~3.3%,血常规分析显示Hb水平为67~114 g/L,红细胞计数(RBC)为(2.33~4.1)×10^(12)/L,平均红细胞体积(MCV)为84.02~91.9 fL,平均红细胞血红蛋白(MCH)为27.8~29.7 pg。γ-珠蛋白基因及β-珠蛋白基因突变检测结果表明:4例病例含有^(A)γ-114~-102缺失杂合子,其中2例合并有^(G)γ-158C>T突变杂合子;4例病例均合并有β-珠蛋白基因突变,基因型分别为Codon 41-42(-TTCT)杂合子突变、Codon 41-42(-TTCT)纯合子突变、IVS-Ⅱ-654(C>T)复合Codon 41-42(-TTCT)突变和Codon17(A>T)复合Codon 71-72(+A)突变。结论:首次在中国人群中发现^(A)γ-114~-102缺失杂合子,且复合β-地中海贫血的病例,临床表现为轻度或中度贫血。^(A)γ-114~-102缺失突变导致非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(nd-HPFH),能够减轻β-地中海贫血患者的贫血程度。

血红蛋白H病复合非缺失型遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合征44例临床分析

目的:探讨复合非缺失型遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合征(nd-HPFH)对血红蛋白H病(Hb H病)的影响。方法:收集2022年1—12月在广西医科大学第一附属医院进行地中海贫血筛查诊断为Hb H病的患者148例,对研究对象进行血常规检查,采用高效液相色谱法进行血红蛋白(Hb)分析;DNA测序方法检测γ-珠蛋白基因突变;荧光PCR熔解曲线法和Gap-PCR法检测α-和β-地中海贫血基因突变。结果:148例Hb H病患者中,检出44例复合nd-HPFH,检出率为29.7%,基因突变类型为^(G)γ-158C>T突变杂合子27例,^(A)γ-225~-222缺失杂合子13例,^(G)γ-158C>T突变纯合子2例,^(G)γ-158C>T突变杂合子复合^(A)γ-225~-222缺失纯合子1例,^(G)γ-158C>T突变杂合子复合^(A)γ-225~-222缺失杂合子1例。Hb分析结果显示,1例胎儿血红蛋白(Hb F)升高,为5.3%;血常规检查结果:轻度贫血19例,中度贫血24例,重度贫血1例。地中海贫血基因检测结果:--^(SEA)/α^(CS)α20例、--^(SEA)/-α^(3.7)13例、--^(SEA)/-α^(4.2)9例、--^(SEA)/α^(QS)α1例和--THAI/-α^(3.7)1例。结论:nd-HPFH基因突变在Hb H病患者中有较高的检出率,nd-HPFH复合Hb H病临床贫血表现存在差异;此类患者大多数Hb F正常,临床上容易漏诊。

补气益精生血中药对人红系细胞组蛋白修饰酶的影响

目的 观察补气益精生血中药对人红系K562细胞株组蛋白修饰酶的影响。方法 运用补气益精生血、补气生血、益精生血的中药分别以高、低浓度对K562细胞株进行诱导,并以丁酸钠作阳性对照。以实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测细胞γ珠蛋白基因基因mRNA水平,采用酶标仪以比色法检测细胞组蛋白脱乙酰基酶(HDAC1、HDAC2),组蛋白乙酰基转移酶(HAT)酶活性水平,PCR方法检测HDAC1、HDAC2、HAT基因mRNA水平,Western Blot方法检测HDAC1、HDAC2、HAT蛋白水平。结果 补气益精高剂量组、补气高剂量组、益精低剂量组中药及丁酸钠均显著提升了γ珠蛋白基因表达水平。补气益精高、低剂量组及益精高、低剂量组的细胞HAT酶活性水平均显著高于空白对照组,而丁酸钠组的HDAC1酶活性水平则显著低于空白对照组。对于HAT基因的mRNA水平,补气益精高、低剂量组,益精高剂量组显著高于空白对照组。Western Blot结果则只有补气益精高剂量组和益精高剂量组的HAT蛋白水平显著高于空白对照组。结论 补气益精生血中药可能通过上调HAT基因的表达进而促进红系细胞内γ珠蛋白基因启动子区组蛋白的乙酰化修饰,其诱导γ珠蛋白基因表达治疗儿童β地中海贫血的分子机制可能与调节组蛋白修饰酶有关。

[Hg(SCN)_4]^(2-)对蛋白质的荧光猝灭反应及其分析应用

在pH=1.4～3.4的酸性介质中,[Hg(SCN)4]2-配阴离子可与牛血清白蛋白(BSA)、γ-球蛋白(γ-G)和血红蛋白(Hb)等蛋白质反应形成复合物,从而引起蛋白质荧光的猝灭.荧光猝灭的程度在一定范围内与Hg(Ⅱ)的浓度呈线性关系,可用于Hg(Ⅱ)的测定.该方法有较高的灵敏度,检出限(3σ)分别为4.4 ng/mL(BSA)、6.5 ng/mL(γ-G)和12.9 ng/mL(Hb),其中以BSA体系灵敏度最高.研究了[Hg(SCN)4]2-与蛋白质相互作用对荧光光谱的影响、适宜的反应条件和影响因素;结合吸收光谱的变化、温度的影响以及某些热力学参数讨论了荧光猝灭反应的机理;并以[Hg(SCN)4]2--BSA体系为例考察了共存物质的影响.结果表明,该方法具有良好的选择性.以BSA为探针采用荧光猝灭法测定了红药水中汞溴红和乙肝疫苗中硫柳汞的含量,结果令人满意.

BCL11A基因对γ-珠蛋白基因转录的影响

本研究旨在探讨B细胞淋巴瘤/白血病11A(B-cell lymphoma/leukemia 11A,BCL11A)基因对γ-珠蛋白基因转录的影响。通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术沉默人红白血病细胞(K562细胞)的BCL11A基因的表达,用实时荧光定量RT-PCR法定量细胞内γ-珠蛋白基因mRNA水平,分析BCL11A基因对γ-珠蛋白基因转录的调控作用。结果表明,所构建的4个siRNA表达载体对BCL11A基因表达的沉默率分别为49.7%、55.4%、78.2%和84.1%。将沉默率为84.1%的siRNA表达载体转导K562细胞,K562细胞的γ-珠蛋白基因的转录水平较转导对照载体质粒升高了2.4倍。结论:BCL11A基因表达被沉默后γ-珠蛋白基因mRNA水平升高显示BCL11A基因对γ-珠蛋白基因表达可能存在负调控。

苦参碱上调K562细胞γ珠蛋白mRNA表达和诱导红系分化

目的研究苦参碱对K562细胞γ珠蛋白mRNA表达及红系分化作用。方法不同水平苦参碱诱导K562细胞6d,应用台盼蓝拒染试验细胞计数、联苯胺染色、Wright-Gimesa染色进行红系分化的研究,同时应用荧光定量RT-PCR技术来相对定量研究药物诱导后Gγ、Aγ珠蛋白基因mRNA表达水平的变化。结果K562细胞增殖抑制程度随苦参碱水平增大而增加,联苯胺染色阳性细胞数由未诱导时的0.7%最高可上升至15.7%,且在形态上出现向红系分化的特征,同时伴有Gγ珠蛋白mRNA表达增加。结论苦参碱可引起K562细胞增殖抑制,在诱导其向红系方向分化中伴有Gγ珠蛋白mRNA表达被上调,为药物诱导治疗β珠蛋白基因缺陷性疾病提供实验依据。

染色质免疫共沉淀分析丁酸钠对γ珠蛋白基因启动子组蛋白乙酰化的作用

目的建立基于Real-time PCR分析的染色质免疫共沉淀(ChIP)方法,探讨丁酸钠对γ-珠蛋白基因启动子区组蛋白乙酰化的作用。方法将K562细胞分为0.5 mmol/L丁酸钠处理48 h组和K562细胞组,每组取1×107细胞用实验。采用抗乙酰化组蛋白H3及H4抗体分别对两组细胞进行ChIP,荧光定量PCR分析不同处理细胞Gγ-、Aγ-珠蛋白基因启动子区乙酰化H3和H4(acH3,acH4)水平。结果各细胞组组内Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域acH3、acH4水平高于阴性对照necdin基因。与K562细胞相比,NaB处理组Gγ-珠蛋白基因启动子区acH3和acH4水平分别升高3.1和2.6倍,Aγ-珠蛋白基因启动子区acH3和acH4水平分别升高3.7和3.2倍(P<0.01)。结论建立了基于荧光定量PCR分析的ChIP技术用于研究珠蛋白基因启动子区域组蛋白的表观遗传修饰,并进一步证实了丁酸钠对γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白乙酰化的作用。

p38磷酸化与K562细胞红系分化的关系

目的探讨p38丝裂原活化的蛋白激酶(p38MAPKs)信号通路直接持续活化在γ-珠蛋白基因转录激活和胎儿血红蛋白(HbF)合成中的作用,为阐明p38磷酸化与K562细胞红系分化的关系提供直接依据。方法经脂质体介导将pCDNA 3.1-MKK3(Glu)和pCDNA3.1-MKK3(Ala)重组质粒转染人红白血病细胞株K562,经G418筛选,反转录(RT)-PCR和Western blot鉴定获得p38持续高磷酸化和低磷酸化的稳定细胞株K562-MKK3(Glu)和K562-MKK3(Ala)。通过RT-PCR和联苯胺染色观察不同细胞模型中γ-珠蛋白基因的表达和HbF的合成。采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。结果不同细胞模型中p38mRNA和蛋白水平表达均无明显变化。但与K562亲本细胞、K562-vect和K562-MKK3(Ala)细胞比较,K562-MKK3(Glu)细胞中p38蛋白磷酸化水平、γ-珠蛋白表达均显著增加。联苯胺染色结果显示,K562亲本细胞、K562-vect、K562-MKK3(Ala)、K562-MKK3(Glu)和SB203580处理的K562-MKK3(Glu)细胞中联苯胺阳性细胞百分率分别为(3.2±1.4)%、(3.7±1.2)%、(2.8±0.9)%、(32.6±5.3)%和(7.8±2.3)%(q=7.56P<0.01)。结论p38MAPKs信号通路直接持续活化可激活γ-珠蛋白基因的转录,并促进HbF的合成。p38磷酸化在K562细胞红系分化中起重要作用。

CDK2促进K562细胞早期红系分化

目的探讨细胞周期调节蛋白CDK2对K562细胞红系分化的影响。方法分别用CDK2表达质粒和干扰RNA分子转染K562细胞,用Western blot法检测过表达或干扰效率,使用real-time PCR和联苯胺染色法检测K562细胞分化。结果 CDK2在K562细胞红系分化早期呈现表达上升趋势;在K562细胞中过表达CDK2可促进hemin诱导的红系分化;反之,干扰K562内源的CDK2表达会对K562红系分化产生抑制作用。结论 CDK2在K562细胞早期红系分化过程中发挥促进作用。

两种新的激活γ珠蛋白基因的中药──盐酸山莨菪碱（654－2）和三尖杉酯碱

检测了３７种中药对Ｋ５６２细胞生长及血红蛋白合成的影响，发现盐酸山莨菪碱（６５４－２）和三尖杉酯碱可以使Ｋ５６２细胞的血红蛋白细胞增加３倍，细胞平均血红蛋白含量增加４倍，γ珠蛋白ｍＲＮＡ的表达分别增加５０％和４０％。电泳结果显示ＨｂＦ和γ珠蛋白肽链。

龟板、黄芪、丹参和党参诱导K562细胞合成γ珠蛋白的实验研究

本研究探讨龟板、黄芪、丹参和党参对K562细胞γ-珠蛋白合成的影响。以K562细胞为体外模型,用联苯胺染色方法确定龟板、黄芪、丹参及党参4种中药诱导K562细胞血红蛋白表达的剂量效应和时间效应,并用Western blot技术检测血红蛋白F(α2γ2)水平。结果表明:龟板、黄芪、丹参和党参作用于K562细胞6天,联苯胺染色阳性率最高分别可达23.5%、19.8%、15.8%和14.5%;Western blot检测显示血红蛋白F表达增加。结论:龟板、黄芪、丹参及党参在体外可诱导K562细胞γ珠蛋白的合成水平增高,从而使血红蛋白F增加。4种中药具有与阳性对照丁酸钠相似的诱导γ珠蛋白合成增加的作用。

氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β-珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT-PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素（Hm）对K562细胞中β-珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示:用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、28及72h后,不仅其γ-珠蛋白mRNA水平升高,其β-珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ-β-珠蛋白基因的转换机制相关。

β地中海贫血的γ珠蛋白诱导治疗及其与microRNA关系

β地中海贫血是β珠蛋白基因突变引起的慢性溶血性贫血,属于遗传性血红蛋白病。此疾病在我国好发于广东、广西、福建等地区,其治疗主要包括输血、铁螯合剂、造血干细胞移植、脾脏切除、诱导Hb F生成以及基因治疗等。该疾病的死亡率仍然较高。近十几年来,针对β珠蛋白合成不足进行的研究主要集中在正常β珠蛋白基因的导入和内源性γ珠蛋白等基因的再次诱导激活两个方面。随着小分子RNA(microRNA,miRNA)的研究成为热点,发现在β地中海贫血中存在多种miRNA的失调表达,部分miRNA参与诱导γ珠蛋白的合成,对β地中海贫血起到治疗作用。因此,研究miRNA与β地中海贫血的关系,可望为靶向治疗β地中海贫血提供理论依据。本文就地中海贫血的γ珠蛋白诱导治疗及其与miRNA的关系作一综述。

丁酸钠对K562细胞系γ珠蛋白基因表达的诱导作用及机制

目的:研究丁酸钠对K562细胞系γ珠蛋白基因表达和胎儿血红蛋白合成的诱导作用及机制。方法:以丁酸钠(0.5 mmoL/L)诱导72h的K562细胞为实验组,设K562亲本细胞和SB203580(10μmol/L)处理1h后用丁酸钠(0.5 mmoL/L)诱导72h的K562细胞为阴性对照组,设羟基脲(100μmol/L)诱导72h的K562细胞为阳性对照。分别提取细胞总RNA和总蛋白。采用RT-PCR、Western blotting和联苯胺染色方法检测γ珠蛋白基因、胎儿血红蛋白和p38表达及p38磷酸化水平。结果:与K562亲本细胞和SB203580处理后丁酸钠诱导的K562细胞相比,丁酸钠诱导的K562细胞中G-γ珠蛋白、A-γ珠蛋白和胎儿血红蛋白的表达均明显上调(P<0.05),p38 mRNA和蛋白水平表达均无明显变化(P>0.05),但p38蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.05)。K562亲本细胞、SB203580处理后丁酸钠诱导的K562细胞和丁酸钠诱导的K562细胞中联苯胺阳性细胞百分率分别为(3.2±0.4)%、(12.7±0.2)%和(36.3±0.8)%(P<0.05)。结论:丁酸钠可以诱导K562细胞高表达γ珠蛋白基因、合成胎儿血红蛋白,p38MAPKs的激活在丁酸钠诱导K562细胞高表达γ珠蛋白基因中发挥重要作用。

红细胞分化相关因子EDRF1的反义RNA下调蛋白激酶C-α mRNA的表达

为了研究通过功能筛选得到的一个新的红细胞分化相关的全长cDNA(命名为EDRF1)的功能 ,选择K5 6 2细胞作为模型细胞来观察反义EDRF1表达对细胞功能的影响。通过快速构建 ,同时得到了正向和反向插入片段的真核表达载体pcDNA3 EDRF1 S(sense)及pcDNA3 AS(antisense) ,并通过改进的LipofectAMINE细胞转染和G418筛选 ,得到了稳定表达的细胞株 ,进行基因组PCR鉴定 ,证明了转染的高效性。NorthemBlot试验的结果表明 ,反义载体转染的K5 6 2细胞中 ,EDRF1在mRNA表达水平上受到下调 ,提示EDRF1反义DNA的表达可能抑制了EDRF1mRNA的正常转录。进一步 ,γ 珠蛋白和PKC α的表达在反义构建质粒转染K5 6 2细胞中的表达均受到下调 ,这可能传递了红细胞分化的负反馈信号 。

MicroRNAs对胎儿血红蛋白表达的调控作用

微小RNA（microRNAs,miRNAs,miRs）是指一群小于22个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们可以在转录后水平调节靶基因、染色体构象改变、细胞增殖、分化以及凋亡。这些单链RNA分子在细胞质中与其它蛋白结合形成miRNA诱导沉默复合物（miRNA-induced silencing complex,miRISC）,再结合到靶基因mRNA的3’-UTR抑制其翻译,通过这种方式miRs对细胞功能产生巨大影响,参与调节了血液疾病、感染、子宫内膜病变及多种癌症等疾病稳态和病态之间的平衡.

KLF1基因对非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征的修饰作用

目的:探讨KLF1基因对非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(HPFH)的修饰作用。方法:选择2017年6月1日至2018年4月30日广西医科大学第一附属医院门诊进行地中海贫血筛查且年龄大于2岁的患者,经血红蛋白(Hb)分析提示胎儿血红蛋白(HbF)升高,且β-地中海贫血基因检测无突变、β珠蛋白基因启动子测序有突变的73例患者进行KLF1基因测序,同时分析其血常规、Hb电泳等表型特征。结果:73例患者中52例有KLF1基因变异,共筛查出8种基因位点突变。有KLF1突变(52例)和无KLF1突变(21例)患者平均红细胞体积(MCV)、HbF、成人血红蛋白A2(HbA2)水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);KLF1基因-251C>G,c.304T>C纯合子(18例)较-251C/G,c.304T/C杂合子(24例)有更高的HbF水平(P<0.05)。结论:KLF1基因与非缺失型HPFH对升高HbF有协同作用;KLF1不同基因型对HbF升高作用不同。

低剂量羟基脲联合丁酸钠对K562细胞γ珠蛋白基因表达的作用

目的:探讨低剂量羟基脲(hydroxyurea,HU)与丁酸钠(sodium butyrate,NaB)联合诱导人白血病细胞株(K562)细胞对γ珠蛋白基因表达的作用。方法:以K562细胞株为研究对象,用不同浓度HU和/或NaB作用于K562细胞,台盼蓝拒染活细胞计数观察细胞生长;联苯胺染色了解细胞红系分化,RT-PCR测定珠蛋白基因γ-mRNA表达。结果:25μmol/L HU与100μmol/L NaB是最佳用药组合,其对细胞生长抑制率为(46.09±1.54)%,与HU100μmol/L(64.31±5.19)%、NaB 500μmol/L(86.25±1.10)%比较差异有显著性(P<0.05);联苯胺染色阳性细胞率达(17.72±0.58)%,与HU100μmol/L(15.72±0.27)%、NaB500μmol/L(14.32±0.74)%比较差异有显著性(P<0.05);与亲本细胞比较Gγ-mRNA表达上调(2.04±0.13)倍,Aγ-mRNA表达上调(1.27±0.01)倍,差异有显著性(P<0.05)。结论:低剂量HU与NaB联合用药能使K562细胞γ珠蛋白基因表达上调,并减轻细胞生长抑制,为临床联合用药提供实验依据。

siRNA沉默Ikaros基因对K562细胞中γ珠蛋白表达的影响

目的:通过siRNA干扰靶基因Ikaros,观察人红白血病细胞株K562细胞中γ珠蛋白的表达变化。方法:设计合成三条针对Ikaros的siRNA寡核苷酸序列,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染siRNA至K562细胞,采用RT-PCR方法筛选出最佳siRNA序列和最佳干扰时间。运用Real-time PCR和Western blotting技术分别检测siRNA沉默Ikaros后K562细胞Ikaros和γ珠蛋白mRNA及蛋白的表达水平,应用联苯胺染色法检测siRNA沉默Ikaros后K562细胞内血红蛋白(Hb)含量。结果:筛选试验表明siRNA3的转染效率最高,达58.7%,siRNA3对Ikaros基因抑制率最高(86.7%),其最佳干扰时间为72h。应用siRNA3沉默Ikaros基因可以上调γ珠蛋白mRNA和蛋白的表达水平,增加K562细胞内Hb含量。结论:siRNA3沉默Ikaros上调γ珠蛋白mRNA和蛋白表达,可能成为治疗重型β-地中海贫血的一种新策略。

黄牛血液丙球蛋白注射液提取与应用

本试验采用健康肥育黄牛血液制备的丙球蛋白注射液,其丙球蛋白含量达40 毫克/毫升,纯度达75% ;对犊牛腹泻治疗有效率达92.5% ,对牛流行热治疗有效率达86.6% 。