^(60)Co γ-射线诱导人膀胱癌EJ细胞中磷酸化组蛋白H2AX焦点形成

目的探讨60Co γ-射线是否可在人膀胱癌EJ细胞中诱导磷酸化组蛋白H2AX焦点形成以及形成的焦点数量与照射剂量及照射后时间的关系。方法免疫印迹法和流式细胞分析法用于检测不同剂量60Co γ-射线照射后EJ细胞中γH2AX蛋白表达的变化;免疫荧光法检测不同剂量照射后以及2 Gy照射后不同时间EJ细胞中γH2AX焦点的数量。结果γ-射线照射后γH2AX蛋白表达明显增加,但量效关系不明显;免疫荧光法可检测γH2AX焦点形成的数量和大小,并且存在剂量-效应关系及有时间依赖性,随着照射剂量的增加,γH2AX焦点数目及大小均明显增加,照射的剂量范围从0.1~4.0 Gy均可检测,照射后24 h仍可检测到γH2AX焦点,但焦点数随时间延长而减少、减弱。结论免疫荧光法检测照射后γH2AX焦点数目可敏感、直观地反映DNA损伤及修复情况,有望成为辐射检测及辐射致癌的好的生物指标。

X射线诱导γH2AX焦点形成的定量分析及其致DNA双链断裂的动态变化

目的 比较DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs^＋/＋）和DNA-PKcs^-/-小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） X射线诱导γH2AX焦点形成的定量分析,并对鼻咽癌SUNE-1细胞进行X射线致DNA DSB动态变化。方法 采用蛋白印迹检测DNA-PKcs蛋白表达情况,细胞免疫荧光检测X射线5 Gy诱导的γH2AX焦点形成,通过ImageJ软件分析γH2AX焦点形成数量的差异。结果 DNA-PKcs在DNA-PKcs^-/-和DNA-PKcs^＋/＋ MEF细胞中分别表达缺失和正常。应用γH2AX焦点/细胞和γH2AX焦点/mm2分析方法动态分析X射线诱导的DNA-PKcs^＋/＋、DNA-PKcs^-/-MEF细胞和SUNE-1细胞DSB形成的总体趋势一致;照后 0.5~1.0 h大量γH2AX焦点形成,DNA-PKcs^＋/＋ MEF细胞于照后6.0 h完成修复,DNA-PKcs^-/-MEF和SUNE-1细胞X射线后于照后24.0 h完成修复。γH2AX焦点/细胞的峰值出现在照后1.0 h,γH2AX焦点/mm2的峰值则出现在照后0.5 h。对于DNA-PKcs^＋/＋和DNA-PKcs^-/-MEF细胞,γH2AX焦点/细胞在照后0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h的不同,而γH2AX焦点/mm2在照后3.0、6.0、12.0 h不同。结论 利用细胞免疫荧光动态检测照后致γH2AX焦点/细胞或γH2AX焦点/mm2的分析方法为动态定量研究DSB损伤及修复提供了新的思路。

基于γH2AX和微核的流式细胞法检测NNK与AαC遗传毒性

目的探讨烟草特有亚硝胺NNK和杂环胺AαC的遗传毒性,对γH2AX焦点与微核分析结果进行比较。方法以0、25、50、100、200和400μg/ml的NNK,0、2.5、5、10、20和40μg/ml的AαC分别染毒中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)24 h后,采用MTT试验检测细胞存活率,采用流式细胞仪检测NNK和AαC各剂量诱导的γH2AX焦点率和微核率,并比较γH2AX焦点率与微核率的差异。结果NNK各剂量的γH2AX焦点率分别为:(1.98±0.15)%、(2.28±0.04)%、(2.86±0.13)%、(3.14±0.09)%、(3.88±0.21)%和(4.34±0.20)%。与阴性对照相比,NNK剂量为25μg/ml时,γH2AX焦点率的差异有统计学意义(P<0.05)。AαC各剂量的γH2AX焦点率分别为:(3.81±0.15)%、(3.24±0.25)%、(3.47±0.21)%、(3.90±0.14)%、(6.12±0.14)%和(11.98±0.24)%。与阴性对照相比,AαC剂量为10μg/ml时γH2AX焦点率的差异有统计学意义(P<0.05)。NNK各剂量的微核率分别为:(1.50±0.22)%、(1.76±0.44)%、(3.26±0.27)%、(4.01±0.88)%、(7.50±0.70)%和(14.67±1.08)%;与阴性对照相比,NNK剂量为50μg/ml时微核率的差异有统计学意义(P<0.05)。AαC各剂量微核率分别为:(1.42±0.50)%、(1.47±0.43)%、(1.42±0.35)%、(1.88±0.15)%、(5.88±1.15)%和(10.67±1.82)%。与阴性对照相比,AαC剂量为20μg/ml时微核率的差异有统计学意义(P<0.05)。结论一定剂量的NNK和AαC可以诱发体外遗传毒性;与流式微核方法相比,流式γH2AX方法灵敏度更高。

质子辐射对人恶性黑色素瘤A375细胞的DNA损伤影响研究

为研究质子辐射对人恶性黑色素瘤的杀伤效应,本研究利用北京HI-13串列加速器提供的15 MeV质子,以0、1、2、4、8 Gy剂量辐照A375细胞,以细胞克隆术和流式细胞术检测A375细胞的克隆形成率、周期阻滞及凋亡率,用免疫荧光法检测2 Gy辐照后细胞的γH2AX焦点数,并与相同条件下的γ射线辐射对比。结果表明,在1~8 Gy剂量下,随着剂量的增加,A375细胞的存活率下降,在4~8 Gy剂量下,细胞的存活率明显低于γ射线。辐照后12 h,细胞G2/M期阻滞随剂量的增加而增加,质子辐射诱导的周期阻滞强于γ射线;辐照后48 h,γ射线诱导的细胞周期阻滞已基本解除,但质子诱导的细胞周期阻滞除1 Gy外,2~8 Gy均未完全解除。辐射诱导的细胞凋亡随照射剂量的增加而增加,随着时间的延长,凋亡比例有所增加,且质子诱导的细胞凋亡率高于γ射线。辐照2 Gy后,γ射线和质子诱导的γH2AX焦点峰值均在照后1 h出现,质子辐射诱导的γH2AX焦点数和大小均高于γ射线。以上结果表明,质子辐射可有效杀伤恶性黑色素瘤A375细胞,在黑色素瘤治疗中有潜在应用价值。

辐射对沉默ATRX的H460细胞增殖以及DNA损伤修复的影响

目的探讨辐射对沉默ATRX的肺癌H460细胞增殖和DNA损伤修复的影响及二者的关系。方法靶向ATRX的3个慢病毒载体转染293T细胞后,慢病毒感染H460细胞,获得ATRX低/无表达的细胞株shATRX1-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460,并以shControl-H460作为对照,利用Western blot检测沉默效率。分别以克隆形成实验检测细胞增殖,免疫荧光技术检测γH2AX和Rad51焦点数,同时以Western blot检测PARP1、γH2AX和Rad51蛋白的表达。结果shControl-H460细胞中可见ATRX表达,而shATRX1-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞中ATRX表达均出现不同程度的降低。克隆形成实验显示,shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞的存活分数(survival fraction,SF)均较shControl-H460细胞降低。shControl-H460和shATRX3-H460细胞经4 Gy照射后1 h,γH2AX焦点最多,而3 h时Rad51焦点最多,而后均降低,与shControl-H460细胞比较,在1和6 h时shATRX3-H460细胞γH2AX焦点,以及1、3和6 h时Rad51焦点显著增加(P<0.05,P<0.001)。而且shATRX3-H460细胞中PARP1、γH2AX和Rad51蛋白在3和6 h时均较shControl-H460细胞表达增加。结论成功地获得靶向沉默ATRX的细胞模型,辐射后细胞增殖能力降低,可能与DNA损伤修复能力降低有关。