金纳米“关-开”型荧光探针测定三价铁离子和L-赖氨酸

以N-乙酰-L-半胱氨酸为配体,通过硼氢化钠还原氯金酸合成单层修饰的、水溶性良好的金纳米簇(AuNCs),采用TEM、FTIR、UV-Vis和PL等分析测试技术对AuNCs的形貌特征和光学性质进行了考察。实验结果表明,该AuNCs具有优良的荧光性能,当激发波长为520 nm时,其最大发射波长为620 nm。研究发现,Fe^(3+)能强烈猝灭AuNCs的荧光,而加入L-赖氨酸后,AuNCs的荧光被恢复。AuNCs的荧光猝灭和恢复的程度与Fe^(3+)和L-赖氨酸的浓度在一定范围内呈线性关系,Fe^(3+)和L-赖氨酸的线性范围分别为11.65~163.35μmol·L^(-1)和13.36~266.64μmol·L^(-1),检出限分别为1.65μmol·L^(-1)和1.28μmol·L^(-1)。本研究建立了一种基于AuNCs荧光的“关-开”型传感体系依次用于Fe^(3+)和L-赖氨酸的检测,该方法具有简单、快速、准确度高、灵敏度高、选择性好等优点。

小白链霉菌全细胞转化L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸的体系构建与优化

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是天然抗菌肽ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)的主要生产菌株。为了提高小白链霉菌生产ε-PL效率,该文构建并优化了全细胞转化L-赖氨酸合成ε-PL体系:葡萄糖质量浓度80 g/L,菌龄12 h,反应温度30℃,L-赖氨酸质量浓度15 g/L,柠檬酸浓度15 g/L,初始反应p H 4.0,硫酸铵质量浓度6 g/L,湿菌体量为1900 g/L。基于该转化体系,实现小白链霉菌在96 h合成ε-PL产量和底物转化率达到13.80 g/L和38.9%,分别是常规摇瓶发酵的4.1、3.2倍。最后,在小白链霉菌中异源表达来自大肠杆菌的L-赖氨酸特异性通透蛋白基因lysp,获得的重组菌S.albulus OE-lysp实现L-赖氨酸利用能力和底物转化率较出发菌株分别提升26%和33%,ε-PL产量增加至17.21 g/L,约为常规摇瓶发酵ε-PL产量的6.4倍,这是文献报道的最高摇瓶规模ε-PL产量。该研究结果一方面说明了通过全细胞转化L-赖氨酸生产ε-PL的可行性,另一方面为S.albulus转化大宗氨基酸L-赖氨酸生产高值ε-PL奠定了坚实的技术基础,具有重要的理论意义和经济价值。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、基质金属蛋白酶-9和赖氨酸去甲基化酶6B在浸润性乳腺癌组织中的表达及其病理诊断价值

目的探讨浸润性乳腺癌组织中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和赖氨酸去甲基化酶6B(KDM6B)蛋白的表达及其与临床病理特征的关系,并分析3种蛋白的相关性及其在浸润性乳腺癌病理诊断中的价值。方法选择2014年1月至2017年12月河南中医药大学第五临床医学院/郑州人民医院病理科保存的124例浸润性乳腺癌患者的手术切除活检标本为研究对象,另选取同期保存的低级别导管内癌组织标本20例、高级别导管内癌组织标本27例、距离浸润性乳腺癌>1 cm处癌旁组织标本22例作为对照组。采用免疫组织化学法检测乳腺癌旁组织、低级别导管内癌、高级别导管内癌及浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表达。分析EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌临床病理特征的关系;采用Spearman法分析浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9、KDM6B蛋白的相关性,受试者操作特征(ROC)曲线评估EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白对浸润性乳腺癌的诊断价值。结果高级别导管内癌和浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于乳腺癌旁组织和低级别导管内癌组织(P<0.05),KDM6B蛋白的相对表达量显著低于癌旁组织和低级别导管内癌组织(P<0.05);浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于高级别导管内癌组织(P<0.05),KDM6B蛋白的相对表达量显著低于高级别导管内癌组织(P<0.05);癌旁组织与低级别导管内癌组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。EMMPRIN、KDM6B蛋白相对表达量与浸润性乳腺癌患者的年龄、肿瘤部位和肿瘤直径无关(P>0.05),MMP-9蛋白相对表达量与浸润性乳腺癌患者的年龄和肿瘤部位无关(P>0.05)。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌的世界卫生组织(WHO)分级、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05),MMP-9蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌的肿瘤直径有关(P<0.05)。浸润性乳腺癌WHO分级Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中,EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量依次升高,KDM6B蛋白的相对表达量依次降低(P<0.05);浸润性乳腺癌淋巴结有转移组EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于无淋巴结转移组(P<0.05),KDM6B蛋白的相对表达量显著低于无淋巴结转移组(P<0.05);TNM分期Ⅲ~Ⅳ期组EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于Ⅰ~Ⅱ期组(P<0.05),KDM6B蛋白的相对表达量显著低于Ⅰ~Ⅱ期组(P<0.05)。在浸润性乳腺癌肿瘤直径≤2 cm、2~5 cm、>5 cm组中MMP-9蛋白的相对表达量依次升高(P<0.05)。Spearman相关性分析显示,浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN与MMP-9蛋白的表达呈显著正相关(r=0.990,P=0.000),EMMPRIN与KDM6B蛋白的表达呈显著负相关(r=-0.606,P=0.000),MMP-9与KDM6B蛋白的表达呈显著负相关(r=-0.612,P=0.000)。ROC曲线分析显示,EMMPRIN蛋白诊断浸润性乳腺癌的曲线下面积(AUC)为0.875[95%置信区间(CI):0.823~0.926,P<0.05],最佳界值为10.043,敏感度为79.0%,特异度为76.8%;MMP-9蛋白诊断浸润性乳腺癌的AUC为0.863(95%CI:0.808~0.917,P<0.05),最佳界值为10.070,敏感度为74.2%,特异度为76.8%;KDM6B蛋白诊断浸润性乳腺癌的AUC为0.267(95%CI:0.196~0.338,P<0.05),最佳界值为11.003,敏感度为71.0%,特异度为98.6%。结论EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白与浸润性乳腺癌的发生发展有关,检测EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表达有助于浸润性乳腺癌的病理诊断及其浸润转移的临床判断。

一种基于疏水基团标记和反相色谱分离的富集策略及其在含赖氨酸多肽分析中的应用

赖氨酸(K)已被广泛用于靶向赖氨酸的交联剂设计、蛋白质复合物的结构解析以及蛋白质-蛋白质相互作用等研究领域。在基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用技术的“鸟枪法”蛋白质组学研究中,复杂生物样品中的蛋白质被酶切成上万条肽段,为直接分析含有K的肽段带来了巨大挑战。鉴于目前缺乏针对含K多肽的有效富集方法,本工作发展了一种基于疏水标记试剂C10-S-S-NHS和反相色谱分离的方法(简称HYTARP),实现对复杂样品中含K多肽的高效富集和鉴定。合成的C10-S-S-NHS试剂可以高效标记含不同数目K的标准肽段,且对HeLa细胞蛋白酶解肽段的标记效率高达96%。通过考察标记肽段在反相色谱中的保留行为,发现大部分被标记的含K肽段在流动相中乙腈比例升高至约57.6%(v/v)时开始洗脱。进一步优化色谱洗脱梯度,发现阶梯式洗脱能够实现对复杂样品酶解肽段中标记的K肽段的高效分离和富集。富集后样品中含K肽段的占比>90%,较富集前提高了35%。富集的含K肽段对应蛋白质的丰度动态范围跨越了5~6个数量级,实现了对复杂样品中低丰度蛋白质的鉴定。综上,本工作发展的HYTARP策略为降低样品复杂度、提高含K肽段及低丰度蛋白质的鉴定覆盖率提供了一种简单、高效的方法。

PLGA/赖氨酸接枝氧化石墨烯纳米粒子复合支架对MC3T3细胞成骨分化的影响

背景:骨损伤后如何有效促进骨再生和骨重建一直是临床骨修复研究中的关键问题,利用生物和降解材料搭载生物活性因子在骨修复中具有优秀的应用前景。目的:探究赖氨酸接枝氧化石墨烯(LGA-g-GO)纳米粒子改性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)复合支架对成骨分化及新骨形成的影响。方法:将PLGA溶于二氯甲烷中,利用溶剂挥发法制备PLGA支架;将氧化石墨烯均匀分散于PLGA溶液中制备PLGA/GO复合支架;利用化学接枝法制备LGA-g-GO纳米粒子,将LGA-g-GO纳米粒子按不同的质量比(1%,2%,3%)与PLGA共混构建出PLGA/LGA-g-GO复合支架。表征5组支架的微观形貌、亲水性、蛋白吸附能力。将MC3T3细胞分别接种于5组支架表面,检测细胞增殖与成骨分化情况。结果与结论:①扫描电镜下可见PLGA支架表面光滑平坦,其余4组支架表面粗糙,并且随着LGA-g-GO纳米粒子加入量的增加,复合支架的表面粗糙程度加重;PLGA/LGA-g-GO(3%)复合支架的水接触角低于其他4组支架(P<0.05);PLGA/LGA-g-GO(1%,2%,3%)复合支架的蛋白吸附能力强于PLGA、PLGA/GO支架(P<0.05);②CCK-8检测显示,PLGA/LGA-g-GO(2%,3%)复合支架可促进MC3T3细胞的增殖;碱性磷酸酶染色与茜素红染色显示,PLGA/LGA-g-GO(2%,3%)组细胞碱性磷酸酶活性高于其他3组(P<0.05),PLGA/GO组、PLGA/LGA-g-GO(1%,2%,3%)组钙沉积多于PLGA组(P<0.05);③结果表明,PLGA/LGA-g-GO复合支架能够促进成骨细胞的增殖和成骨分化,有利于骨损伤后的骨再生和骨重建。

ε-多聚赖氨酸的研究进展

ε-多聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类食品防腐剂.ε-多聚赖氨酸抑菌谱广,在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果,尤其对其他天然防腐剂不易抑制的革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好.采用小白色链霉菌(Streptomyces albulus) 发酵制得ε-多聚赖氨酸的合成方法是较为理想的. 在发酵生产中,甘油和葡萄糖是最好的碳源,氮源方面,硫酸铵和酵母膏的混合使用更有利于ε-多聚赖氨酸产物的形成,发酵生产的最适温度是25～30℃,产物形成的最佳pH为4.0.

多聚赖氨酸-硅纳米颗粒的生物相容性研究

背景与目的:多聚赖氨酸-硅纳米颗粒是一种新型的非病毒纳米颗粒基因传递载体。本研究主要阐述其生物相容性,为其进一步的体内应用提供实验依据。方法:细胞转染和流式细胞仪分析在含血清培养基中多聚赖氨酸-硅纳米颗粒介导质粒DNA和反义寡核苷酸的转染能力,随后通过血浆蛋白反应滤过试验和红细胞聚集试验进一步评价其生物相容性。结果:在含血清培养基中,多聚赖氨酸-硅纳米颗粒介导质粒DNA和反义寡核苷酸传递的能力显著下降。多聚赖氨酸-硅纳米颗粒/DNA(/ODN)复合物可与小鼠血浆蛋白成分结合,并可引起红细胞聚集。结论:多聚赖氨酸-硅纳米颗粒可能与含血清培养基中的血浆蛋白相互作用,影响体外细胞转染效率。多聚赖氨酸-硅纳米颗粒可能与体内外周血血浆蛋白和外周血红细胞反应而影响其体内基因传递能力,其生物相容性还有待于进一步提高。

海藻酸盐-多聚赖氨酸-海藻酸盐微胶囊膜的强度和生物相容度测定

目的 :了解我们所制作的海藻酸盐 多聚赖氨酸 海藻酸盐 (APA)微囊的生物相容性、机械和化学强度。方法 :用静电微囊发生器制作海藻酸盐 多聚赖氨酸 海藻酸盐的APA微胶珠及枸橼酸钠液化微珠芯的APA微胶囊。用振摇法比较微囊与微珠的机械强度。用不同酸碱度溶液测定微囊的化学强度。用微囊小鼠腹腔移植法观察APA微囊的生物相容度。结果 :①机械振摇 48h的破损率 :微囊为 5 % ;微珠为 31% ;②Ph 7 4对APA微囊的化学损伤最小 ;③移植后 1周、2周、4周、8周和 10周从小鼠腹腔内取出的微囊 95 %～ 98%为完整、圆形、表面光滑、无明显的结缔组织包绕。结论 :我们所制作的APA微囊具有较好的生物相容度。

ε-多聚赖氨酸产生菌的筛选及16SrDNA测序鉴定

利用ε-多聚赖氨酸(ε-PL)与亚甲基蓝在静电排斥的作用下能够形成透明圈的性质,初步筛选出10株产ε-PL的菌。然后摇瓶发酵复筛,根据发酵上清液与DR(dragendorff)试剂反应和纸层析两者均成阳性反应,以及参照Itzhaki方法计算发酵产物中ε-PL产量,从而筛选出编号为4#、8#、Y#的三株产量较高的菌株,其ε-PL产量分别达到0.757、0.751、0.808g/L。再采用基于16S rDNA序列分析和系统发育分析的方法,对4#、8#、Y#三株菌进行分子生物学鉴定,最终确定4#可能是Delftia acidovorans,8#可能是Stenotrophomonas maltophilias,Y#可能是Streptomyces griseolus。

长期体外培养条件下海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的变化

目的:了解在体外长期培养的条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的形态及其细胞活率的变化。方法:实验于2003-09/2004-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学室完成。①材料:细胞为牛肾上腺嗜铬细胞;海藻酸钠和多聚赖氨酸由SIGMA公司提供;DMEM-H培养液由GIBCO公司提供;加强型小牛血清由HYCLONE公司提供。②方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微胶囊包裹牛肾上腺嗜铬细胞,以含有体积分数为0.1的小牛血清的DMEM-H培养基培养于CO2孵箱中,定期换液。③观察指标:在光学显微镜下观察微囊及囊内细胞的形态;以锥虫蓝染色法计数囊内细胞的数量和存活率,观察时间为8个月以上。结果:①微囊包裹后1d时,光镜下见微囊呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内为单个细胞,均匀散在分布。体外培养35d时,微囊仍呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内细胞聚集成体积较小的团块。体外培养240d时,微囊形态无明显变化;囊内大部分细胞已聚集成多个体积较大的团块,少数微囊内的细胞聚集成一个大的细胞团。②随着培养时间的延长,囊内细胞数量逐渐减少,从最初的(54±10)个/囊减少到培养243d时的(35±7)个/囊,但差异无显著性意义(P>0.05);囊内细胞的活率无明显改变,开始为95%,到培养243d时仍有93%的细胞存活。结论:在体外培养条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞可较长时间地保持良好状态。

表面改性聚合物左旋聚乳酸-多聚赖氨酸可促进骨髓基质细胞的初始黏附

背景:通过增加表面活性基团对生物支架材料进行表面改性,可提高材料对细胞的亲和力,有效提高材料的细胞相容性。目的:合成表面改性聚合膜左旋聚乳酸-多聚赖氨酸(PLLA-PLL),并观察其对骨髓基质细胞黏附、增殖的影响。方法:通过开环聚合反应合成不同组分高分子聚合膜PLLA139-PLL131,PLLA77-PLL72,PLLA45-PLL246,将人骨髓基质细胞接种至不同组分聚合膜PLLA-PLL表面、左旋聚乳酸及商品化的细胞培养板,寻找最佳PLLA-PLL组分。结果与结论:与左旋聚乳酸比较,不同组分PLLA-PLL聚合膜细胞黏附量均升高,以PLLA77-PLL72聚合膜组增高显著(P<0.05),所以最佳组分为PLLA77-PLL72,连续培养结果显示PLLA77-PLL72聚合膜表面骨髓基质细胞骨架蛋白表达丰富,清晰有序,增殖实验也证实了PLLA77-PLL72聚合膜可促进骨髓基质细胞增殖。

菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外标记兔骨髓基质细胞

背景:为明确细胞移植后症状改善是否由移植所致,既往多采用侵袭性方法,但是这种方法不适用于动态追踪及人体研究。如果能够在合适示踪剂的帮助下,采用无创伤性影像学技术在活体识别、跟踪移植后细胞的存活状态,将显著提高细胞移植疗法的学术价值。目的:初步探讨菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外磁性标记兔骨髓基质细胞的可行性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/08在珠江医院神经外科实验室完成。材料:2月龄新西兰大白兔8只,由广州中医药大学实验动物中心提供。菲立磁为AdvancedMagnetic公司产品,多聚赖氨酸为sigma公司产品。方法:无菌条件下穿刺抽取兔股骨骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,收集第2代细胞,加入含白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子及胎牛血清的神经干细胞培养基诱导5d。将50mg/L菲立磁和1.5mg/L多聚赖氨酸混合,振荡30min后,将复合物加入到细胞培养基中进行标记,孵育细胞24h。主要观察指标:骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化情况,细胞内铁的鉴定,菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对细胞增殖或分化的影响。结果:骨髓基质细胞诱导后可见少量细胞的胞体变圆变大,突起缩短,随时间延长,圆形细胞逐渐增多,部分聚集成簇、成球,FITC荧光染色示巢蛋白呈阳性表达。普鲁士蓝染色结果显示99%以上骨髓基质细胞的胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。在含菲立磁-多聚赖氨酸复合物的培养基中,骨髓基质细胞可继续增殖和分化,但增殖分裂后细胞质内铁颗粒数量较增殖前有所减少,经鉴定部分为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞。结论:菲立磁-多聚赖氨酸复合物可在体外高效标记骨髓基质细胞,且标记后细胞的活性、增殖和分化能力不受影响。

多聚赖氨酸-乙二胺四乙酸交联物抑制兔晶状体上皮细胞生长的研究

背景后囊膜混浊（PCO）是现代白内障囊外摘出术后引起视力下降的主要原因。研究证实多聚赖氨酸-乙二胺四乙酸（EDTA）交联物（PLE）能够降低兔PCO的发生率。目的研究PLE对体外培养的兔晶状体上皮细胞（LECs）生长的抑制作用及有效药物浓度。方法取3月龄新西兰白兔晶状体前囊膜进行体外植块培养获得兔LECs并进行传代，取第2～3代传代培养的LECs消化后按1×10^5个／ml密度接种于96孔培养板中。在培养皿中加入12．5、25．0、50．0、100．0μmol／L的PLE，培养皿中加入DMSO培养液作为对照组。PLE作用48h用MTT比色法测定PLE对兔LECs增生的抑制作用并计算各浓度PLE组的吸光度（A490）值及其抑制率。结果≤25．0μmol／LPLE组可见细胞生长及形态改变不明显。≥50．0μmol／LPLE各组可见细胞生长及形态有明显改变，增生缓慢，生长差，数量减少，贴壁能力减弱。12．5、25．0、50．0、100．0μmol／L的PLE组LECs的A490值分别为0．278±0．013、0．266±0．028、0．260±O．022和0．247±0．012，均明显低于DMSO对照组的O．311±0．038（P=0．035、0．011、0．009、0．013），且呈明显的剂量一效应依赖关系。12．5、25．0、50．0、100．0μmol／LPLE组对兔LECs的抑制率分别为10．61％、14．47％、16．40％和20．58％。结论PLE可以浓度依赖的方式抑制兔LECs的生长，可为临床筛选出防治PCO的药物提供依据。

二甲双胍改善由C9ORF72肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤

目的·探索C9ORF72肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆(amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia,ALS/FTD)相关的多聚甘氨酸-精氨酸(poly-glycine-arginine,poly-GR)对线粒体形态及功能的影响,并分析二甲双胍对由poly-GR诱导的线粒体损伤的修复作用及其可能的机制。方法·采用慢病毒感染法分别构建能够稳定表达50个重复甘氨酸-精氨酸序列[(glycine-arginine)50,(GR)_(50)]和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的SK-N-SH细胞,即(GR)_(50)-SK细胞株和GFP CTRL-SK细胞株。采用蛋白质印迹法(Western blotting)验证已构建细胞中(GR)_(50)蛋白的表达水平,并采用荧光显微镜观察GFP CTRL-SK细胞的GFP表达。采用碘化丙啶(propidium iodine,PI)染色分别检测(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞的凋亡水平。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)染色分析(GR)_(50)蛋白在细胞内的定位情况。采用超氧化物指示剂MitoSOX Red分别对(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞的氧自由基进行染色,并利用荧光显微镜观察红色荧光强度以评估线粒体活性氧水平的变化。采用透射电镜分别观察(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞的线粒体形态。采用Western blotting检测(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞的蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)及其磷酸化水平。利用SC79激活(GR)_(50)-SK细胞中的AKT,并采用MitoSOX Red染色及PI染色实验分析AKT磷酸化后细胞的线粒体活性氧水平及凋亡水平。利用二甲双胍处理(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞,随后通过上述方法以及ATP检测试剂盒检测细胞的凋亡水平、线粒体活性氧水平、线粒体形态、AKT及其磷酸化水平、ATP浓度情况。结果·Western blotting结果提示(GR)_(50)-SK细胞构建成功,荧光显微镜的观察结果显示GFP CTRL-SK细胞构建成功。PI染色结果显示,(GR)_(50)-SK细胞较GFP CTRL-SK细胞的凋亡水平更高(P=0.016)。IF结果提示,(GR)_(50)-SK细胞中(GR)_(50)蛋白与线粒体存在部分共定位。与GFP CTRL-SK细胞相比,(GR)_(50)-SK细胞的线粒体形态及结构存在明显异常,其活性氧水平明显上升。(GR)_(50)-SK细胞中的AKT水平与GFP CTRL-SK细胞相仿,但磷酸化AKT水平显著下降。SC79处理(GR)_(50)-SK细胞后,可显著上调其AKT磷酸化水平,并下调其活性氧水平及凋亡水平。二甲双胍处理可明显上调(GR)_(50)-SK细胞中的磷酸化AKT水平,但对AKT水平无影响;可重塑该细胞中的部分线粒体形态结构、降低活性氧水平、增加ATP的生成(P=0.000),并下调细胞的凋亡水平(P=0.000)。结论·(GR)_(50)可通过下调AKT磷酸化引起线粒体形态及功能异常,并促进细胞凋亡;而二甲双胍则可抑制由(GR)_(50)蛋白诱导的上述病理事件的发生。

甲状旁腺激素(1-34)、多聚赖氨酸应用于口腔种植体表面促成骨作用研究

目的研究甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)(1-34)、多聚赖氨酸应用于种植体表面的促成骨作用。方法将PTH(1-34)和多聚赖氨酸通过层层自组装的方式涂层到种植体表面。按照涂层制备方法和PTH(1-34)浓度将种植体分为4个组:PLL载体组(A组)、10μg组(B组)、100μg组(C组)和空白对照组(D组)。使用ELISA法探索该涂层的体外药物释放规律;将小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1接种于涂层后的种植体表面,使用MTT法、碱性磷酸酶半定量、PCR等方法,检测该涂层在体外条件下对成骨细胞生物学行为的影响。结果通过层层自组装技术于钛种植体表面制成的PLL-PTH(1-34)聚电解质多层膜涂层在初始阶段表现出明显的释放过程,随后释放程度趋于平缓,第14天时仍可检出PTH(1-34)。MTT检测:第5天时C组OD值(1.738±0.026)与第1天(1.663±0.045)相比有明显升高(P=0.0219)。碱性磷酸酶半定量:第14天时,C组(3.377±0.336)U/gprot明显高于A组(2.537±0.083)U/gprot、B组(2.843±0.060)U/gprot和D组(2.063±0.061)U/gprot,差异均有统计学意义(P<0.05)。PCR检测:ALP基因于第7天时各组表达水平最高,且C组明显高于A、B、D三组,差异均有统计学意义(P<0.05);OCN基因于第14天时各组表达水平最高,且C组明显高于A、B、D三组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在钛种植体表面可以通过层层自组装技术制成PLL-PTH(1-34)聚电解质多层膜涂层。通过该技术可以实现PTH(1-34)较长时间的局部释放,从而促进其表面成骨细胞的增殖和分化。

海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸微囊植入大鼠体内的生物相容性的实验研究

研究海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸(BPA)微囊在大鼠体内的生物相容性。用静电微囊发生仪制备BPA微囊,将4mL空微囊分别注射于20只Sprague-Dawley大鼠腹腔内,于1、2、4、8周各取5只大鼠,处死后用生理盐水灌洗腹腔,收集灌洗液,待微囊全部沉淀后,计算其中空微囊数并观察微囊的形态改变。结果表明:移植后1、2、4、8周从大鼠腹腔内取出的微囊95%～98%为完整、圆形、表面光滑、无明显的结缔组织包绕。说明我们所制作的BPA微囊具有较好的生物相容性。

奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定及ε-多聚赖氨酸的抑菌作用

为了研究ε-多聚赖氨酸对奶牛子宫内膜炎病原菌的抑菌作用,采集杭州地区患牛子宫内膜分泌物病料26份进行细菌分离鉴定及药敏试验,并采用试管稀释法测定了ε-多聚赖氨酸对分离到的病原菌的最小抑菌浓度。结果,从26头子宫内膜炎患牛的子宫分泌物中检测到21份分泌物中有细菌,分别是凝固酶阴性葡萄球菌(19.2%,5/26)、牛链球菌(15.4%,4/26)、化脓链球菌(7.7%,2/26)、大肠杆菌(15.4%,4/26)、普通变形杆菌(30.8%,8/26)、肺炎克雷伯菌(11.5%,3/26);5份分泌物中未检测到细菌(19.2%,5/26)。药敏试验结果表明,多数病原菌对多西环素和苯唑青霉素耐药,但对环丙沙星、庆大霉素、氧氟沙星敏感。试管稀释法结果表明,ε-多聚赖氨酸对子宫分离菌的最小抑菌浓度(MIC)为45～215μg/mL。由于ε-多聚赖氨酸对奶牛子宫内膜炎致病菌具有良好的抑菌作用以及在食品中的安全性,有必要进一步研究其对奶牛子宫内膜炎的治疗作用。

多聚左旋赖氨酸包被玻片的可视化检测方法

分子量15万—30万的多聚左旋赖氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)常被用于盖玻片的包被,以促进培养细胞贴壁或切片组织黏附。然而,用市场上劣质的PLL将使组织或细胞不能牢固黏附在包被玻片上,进而导致实验失败。因而,建立实用直观的PLL质量检测方法,对于PLL包被玻片的质量控制至关重要。然而,目前世界上未见相关方法报道。因此,作者本着实用原则建立了一种实验室可视化检测盖玻片表面PLL的方法,这种方法利用化学反应将异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)添加到PLL的侧链氨基(-NH2)上,再利用荧光成像检测附着在玻片表面的FITC-PLL,同时荧光照片也可以通过Fiji软件进行分析,获得定量的检测结果。利用此方法,研究发现利用不同浓度的PLL包被盖玻片后,PLL偶联的FITC荧光强度和PLL浓度成正相关。通过检测市面上的两种商品化PLL,与对照相比,两种商品化PLL附着密度极低,推断利用这两种不合格的PLL包被玻片,将导致切片样本从玻片上脱落。此方法适用于实验室自制或商品化PLL黏附盖玻片质量的可视化检测,也为附着在玻璃或塑料表面的带有-NH2基团物质的定量检测方法的建立提供参考。

解木糖赖氨酸芽孢杆菌发酵和生物催化产生L-2-氨基己二酸

以解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2为出发菌株,110 mmol/L L-赖氨酸单盐酸盐为发酵前体,144 h发酵后L-2-氨基己二酸浓度达到10.4 mmol/L,产率为9.5%.以解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2全细胞为生物催化剂,利用共生的L-赖氨酸6-脱氢酶和?-1-哌啶啉-6-羧酸脱氢酶催化L-赖氨酸单盐酸盐转化为L-2-氨基己二酸.最优条件为:细胞浓度为45 g(干重)/L,L-赖氨酸单盐酸盐浓度为100 mmol/L,pH=7.0,温度为30℃,反应时间144 h.在最优条件下,从100 mmol/L L-赖氨酸单盐酸盐产生90 mmol/L L-2-氨基己二酸,产率为90%.我们推测了生物催化过程中L-2-氨基己二酸产生的反应机理.

钛材料表面固定多聚赖氨酸-肝素纳米颗粒以改善血液相容性的研究

通过将多聚赖氨酸(PLL)-肝素纳米颗粒固定在多巴胺涂覆的钛表面,以改善其血液相容性。利用zeta电位仪及甲苯胺蓝法检测纳米颗粒的粒径及成分,通过傅立叶变换红外光谱(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)及水接触角等对颗粒固定前后表面理化性质的变化进行表征。通过体外血小板粘附实验、肝素释放及活化部分凝血活酶时间(APTT)检测对改性样品的血液相容性进行评价。结果表明,PLL-肝素纳米颗粒成功固定在多巴胺沉积的钛表面,纳米颗粒的固定有效降低钛材料表面血小板的粘附行为,大大提高了血液相容性。