卵巢癌细胞对CD8^＋T细胞ζ链表达及分泌Tc1／Tc2型细胞因子的影响

目的:通过研究卵巢癌细胞对CD8+ T细胞ζ链表达及分泌Tc1/Tc2型细胞因子影响,探讨其在卵巢癌免疫抑制中的作用。方法:Western印迹方法检测3株卵巢癌细胞(OVCAR3、CAOV3和SKOV3)培养上清液作用后CD8+ T细胞ζ链蛋白的表达;分别采用MTT、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法观察卵巢癌细胞培养上清液对CD8+ T细胞增殖和分泌Tc1/Tc2型细胞因子的影响。结果:(1)与对照组比较,OVCAR3、CAOV3和SK-OV3细胞培养上清液均能抑制CD8+ T细胞中ζ链的表达,ζ链蛋白平均吸光度值分别为(0.346±0.004;0.349±0.007;0.387±0.011;0.616±0.013);(2)3株卵巢癌细胞培养上清液皆抑制CD8+ T细胞增殖,分泌的Tc1细胞因子IFN-γ显著降低,而Tc2细胞因子IL-10显著增高。结论:卵巢癌细胞源性的免疫抑制因子通过下调CD8+ T细胞ζ链的表达,从而抑制其增殖并导致Tc1/Tc2细胞因子分泌失衡,这可能是卵巢癌诱导腹腔免疫抑制的机制之一。

SEA对PML-RARα多肽体外诱导外周血单个核细胞TCRζ链表达的作用

目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA)。分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR G reenⅠ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-△△C t分析TCRζ链表达差异。结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降。结论:超抗原SEA联合PML-RARα多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点。

SEA联合K562细胞体外诱导正常人脐带血单核细胞TCRζ链表达的作用

目的:研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对K562细胞体外诱导脐血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:常规分离4例脐带血单核细胞,分别与抗CD3单克隆抗体、单纯K562细胞、SEA以及SEA联合K562细胞共培养,诱导T细胞活化增殖,并设空白对照组。刺激培养48 h后收集各组细胞提取mRNA并合成cD-NA,采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-ΔΔCt计算TCRζ链表达差异倍数。结果:抗CD3单抗组、K562细胞组、SEA组、SEA联合K562细胞组诱导培养T细胞中TCRζ链表达差异倍数分别是(4.52±0.96)、(1.65±0.26)、(1.43±0.44)、(3.41±0.30),表明各组均有活化T细胞的作用,但各组TCRζ链表达水平有差异,其中SEA联合k562细胞组的T细胞ζ链基因表达均明显高于单纯k562组及单纯SEA组(P<0.01)。结论:超抗原SEA有助于增强K562细胞体外诱导T细胞活化作用。

弥漫大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR基因修饰T细胞TCRζ链基因的表达

目的:分析DLBCL相关抗原特异TCR基因修饰T细胞经肿瘤细胞刺激活化前后TCRζ链基因表达水平的变化。方法:利用SYBRGreenⅠ荧光定量PCR,相对定量检测TCR基因修饰T细胞活化前后TCRζ链基因的表达情况,β2微球蛋白基因(β2M)为内参照,根据相对定量公式:2-△Ct×100%和2-△△Ct,计算TCR基因修饰T细胞活化前后TCRζ链基因的相对表达水平及其差异情况。结果:与未转染T细胞的TCRζ基因mRNA表达量(1.74±0.28)%相比,TCR转基因修饰T细胞TCRζ基因mRNA的表达水平没有发生明显的变化,表达量为(1.78±0.22)%;而经效/靶细胞(TCR基因修饰T细胞/Toledo细胞)混合培养后,活化的TCR基因修饰T细胞的TCRζ基因mRNA表达水平为(11.54±1.98)%,明显高于未刺激培养之前的TCR基因修饰T细胞和未转染T细胞的TCRζ基因的表达水平(P<0.05),分别增长了(6.59±0.80)倍和(6.48±0.36)倍。结论:TCR转基因修饰T细胞受到抗原的刺激而活化,TCRζ链基因的表达相应增加。

乳腺癌组织中TCR-ζ链的表达及外周血中CD8^+CD28^+和CD8^+CD28^-、CD95表达临床意义

目的分析TCR-ζ链在乳腺癌组织中的表达及临床意义。方法收集2015年5月~2017年8月延安大学附属医院(以下简称“我院”)经过手术及病理证实的乳腺癌患者30例(对应肿瘤组织标本,癌旁组织),收集同期来我院体检及治疗健康人群、乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病各30例作为对照,采用流式细胞技术对乳腺癌组织、癌旁组织及正常乳腺组织TCR-ζ链进行检测,并且检测乳腺癌患者血清CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链的表达,分析乳腺癌组织、正常乳腺组织及癌旁组织TCRζ链的表达;外周血中各组CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链表达对比及外周血、癌组织中TCRζ链表达与乳腺癌病理特征的关系。结果正常乳腺组织、癌旁组织、乳腺癌组织TCR-ζ链相对表达量差异有统计学意义(P < 0.05),其中癌旁组织、乳腺组织表达水平均高于正常乳腺组织(P < 0.05)。外周血中CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链等免疫指标在乳腺癌、乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病四种类型患者间差异有统计学意义(P < 0.05),其中乳腺癌患者血清CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链表达水平高于乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病及健康人群相应水平,差异有统计学意义(P < 0.05);外周血TCR-ζ链表达水平与癌原发灶大小、淋巴结是否转移、手术前后及CA125水平关系分析差异有统计学意义(P < 0.05)。结论检测外周血TCR-ζ链对乳腺癌患者进行提前筛选、诊断或了解患者病情状况,其在临床上是非常有意义的指标。

人T细胞受体ζ链基因在昆虫细胞中的表达

目的 :克隆人T细胞受体 (TCR) ζ链基因 ,运用昆虫杆状病毒系统表达该蛋白。方法 :用RT PCR从人外周血单个核细胞 (PBMC)中克隆TCRζ链cDNA ,构建到昆虫杆状病毒系统专用的Transfer载体中 ,并与杆状病毒共转染昆虫sf9细胞。用SDS PAGE电泳和用小鼠抗人ζ链蛋白的单抗在流式细胞仪中鉴定重组蛋白的表达。 结果 :克隆的人TCRζ链cD NA插入昆虫杆状病毒载体 ,并在昆虫sf9细胞中特异地表达了蛋白。表达量约为细胞裂解上清液总蛋白的 11%。经SDS PAGE分析 ,其分子量大小与预期的重组ζ链蛋白一致。用胞内标记流式细胞仪检测证实 ,转染重组杆状病毒的昆虫细胞含有人的 ζ链蛋白。 结论 :从人PBMC中成功克隆了T细胞受体 ζ链的基因 ,并在昆虫细胞中获得高效表达。用生物工程技术获得TCRζ链蛋白有利于深入研究其生物学功能。

肾细胞癌和膀胱癌患者的T和NK细胞ζ链水平与临床意义

目的 研究肾细胞癌和膀胱癌患者外周血T和NK细胞 ζ链水平与肿瘤发展进程的相关性及其临床意义。方法 采用 3种荧光标记的抗CD3、CD5 6和 ζ链单抗及流式细胞仪测定 5 8例肾细胞癌、2 2例膀胱癌患者及 14名健康人外周血T和NK细胞 ζ链蛋白的水平。 结果 肾细胞癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者的ζ链水平在T细胞中分别下降到健康对照组的 5 9.5 %、37.6 %和 2 1.3% ;在NK细胞中分别下降到对照组水平的 6 2 .2 %、2 7.1%和 18.8%。膀胱癌患者 ζ链的水平在T细胞中分别下降到对照组的 37.6 %、2 9.5 %和 18.9% ;在NK细胞中分别下降到对照组的 35 .4 %、2 0 .8%和 5 .8%。检测的标本中还有 17.5 % (14 / 80 )的患者T和NK细胞 ζ链水平在正常范围内。Ⅲ期患者外周血中T和NK细胞的比值与健康对照组相比显著下降。结论 肾细胞癌和膀胱癌患者体内T和NK细胞的ζ链水平总体上与肿瘤的发展进程一致。T和NK细胞比值显著下降可能预示患者病情严重 ,T和NK细胞 ζ链水平正常的肿瘤患者可能是免疫治疗的适应证。

利用T淋巴细胞受体ζ链的变化预测肿瘤坏死因子拮抗剂治疗类风湿关节炎的疗效

目的探讨ζ链呈低水平表达T淋巴细胞（TCRζmT淋巴细胞）在预测类风湿关节炎（RA）患者对肿瘤坏死因子（TNF）拮抗剂疗效反应中的意义，寻找早期预测患者对生物制剂疗效反应的指标。方法12例血清学阳性的活动性（DAS28〉5．1）RA患者接受了标准方案的英夫利西单抗治疗，在第14周和第30周时根据欧洲抗风湿联盟（EULAR）临床疗效反应标准对患者的疗效进行评价，并将患者分为疗效显著、疗效中等、疗效不住3组。每例患者在英夫利西单抗治疗前以及治疗第14周和第30周时采集外周血，采用流式细胞仪的方法对系列标本中不同细胞亚群、TCRζ的表达水平进行研究，并对TCRζdmT淋巴细胞的移动能力进行分析，并将疗效与TCRζdmT淋巴细胞的变化进行相关分析。结果TCRζdmT淋巴细胞具有很强的移动能力，它们选择性地由外周血向炎症部位移动，导致RA滑液中TCRζdmT淋巴细胞的数量明显多于相应的外周血（P〈0．05）。12例患者中3例疗效显著，6例疗效中等，3例疗效不佳。用药至第30周时临床反应判定为良好的患者，在第14周时外周血中均有CD4＋TCRζdmT淋巴细胞的聚集；而疗效不佳的患者外周血中这群细胞数量反而下降；14周时TCRζdmT淋巴细胞变化的百分数与30周时DAS28评分之间密切相关（r2=0．6835，P〈0．01）。结论TNF拮抗剂是治疗RA有效的药物，用药至第14周时外周血中TCRζdmT淋巴细胞数量的变化可以预测用药至第30周时的疗效，阻止TCRζdmT效应T淋巴细胞由外周血向关节腔的移动是TNF拮抗剂在RA中发挥作用的重要机制。

外周血IL-38、CD247蛋白及CD247mRNA表达对类风湿关节炎患者疾病发展的评估价值

目的探讨外周血白细胞介素-38(IL-38)、T细胞受体CD3ζ链(CD247)蛋白及CD247信使RNA(mRNA)的表达对类风湿关节炎(RA)患者疾病发展的评估价值。方法选取健康志愿者(HC组,n=12)、RA患者(RA组,n=56)及其他风湿免疫性疾病患者(非RA组,n=23)为研究对象,收集3组受检者年龄、性别、体质量指数(BMI)及RA组患者的病程,抽取RA及HC组受检者空腹静脉血检测C反应蛋白(CRP)和血沉(ESR),抽取RA患者治疗前后、非RA组治疗前及HC组被检者空腹静脉血,采用ELISA法检测血清IL-38、CD247蛋白的表达,采用RT-qPCR法检测RA组和HC组外周血单个核细胞(PBMC)中CD247 mRNA的表达,采用28个关节疾病活动性评分(DAS28)评估RA组患者疾病活动度的缓解期及活动期(低、中、高疾病活动度),采用斯皮尔曼相关评估RA患者疾病活动度与外周血IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA表达的相关性,采用受试者工作特征曲线(ROC)评估RA组患者IL-38、CD247蛋白及mRNA单独和联合诊断RA的效能。结果RA组患者血清IL-38表达高于非RA组和HC组受检者(P<0.05),且随疾病活动度升高而增高(P<0.05),治疗后IL-38表达降低(P<0.05);RA组缓解期患者与HC组比较,差异无统计学意义(P>0.05);与中低疾病活动度RA组、缓解组及HC组相比,高疾病活动度组RA患者外周血中CD247蛋白和mRNA表达降低(P<0.05),治疗后CD247表达升高(P<0.05),RA组缓解期患者CD247蛋白及mRNA表达与HC组比较差异均无统计学意义(P>0.05);RA患者疾病活动度程度与IL-38表达呈正相关、与CD247蛋白及mRNA呈负相关(P<0.01),IL-38与CRP、ESR呈正相关(P<0.05),CD247蛋白表达与CRP呈负相关(P<0.05);单指标分析显示IL-38诊断效能最佳曲线下面积(AUC)为0.841,联合分析显示IL-38+CD247 mRNA的AUC可达0.882。结论外周血IL-38、CD247蛋白及mRNA与RA患者疾病的发生发展有关,IL-38可能是RA疾病诊断的潜在生物标志物。

Elf-1基因在急性髓细胞性白血病中的表达情况

目的:建立实时定量PCR检测Elf-1基因表达水平的方法,了解急性髓细胞性白血病(AML)患者外周血Elf-1基因表达水平。方法:采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量分析法检测33例AML患者:M2型17例、M3型6例、M5型10例和20例健康人外周血的单核细胞的Elf-1表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,采用公式2-ΔCt×100%计算Elf-1基因表达水平。结果:AML组Elf-1表达水平(13.518±19.197)%明显高于健康对照组(2.044±1.321)%(P<0.01),不同AML亚型之间Elf-1的表达水平没有显著性差异(P=0.52),但各亚型AML的Elf-1的表达水平均与健康对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。结论:建立SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR分析外周血Elf-1表达水平的方法,检测急性髓细胞性白血病Elf-1基因高表达情况。

Zeta链在肾脏相关疾病中表达的研究进展

Zeta（ζ）链在T细胞和自然杀伤细胞信号传递功能中起着重要作用，其异常表达导致免疫功能受损可能作为某些疾病发病机制中的重要一环，已发现在系统性红斑狼疮（SLE）、肾细胞癌及血液透析患者中存在。SLE患者中，T细胞受体（TCR）ζ链的缺失率高达78％，而且TC醚基因和SLE的遗传易患部位同位于染色体1q，提示TCRζ飚链表达异常可能与SLE发病机制有关；TCRζ链的下降涉及多种分子机制。肾细胞癌患者中ζ链的水平可能与肿瘤发展的进程相关，并可能影响其预后。血液透析患者体内ζ链的表达下降可能与其细胞免疫缺陷相关。最近已发现，《链的表达异常存在于特发性肾病综合征患者中，其作用如何值得进一步研究。

慢性淋巴细胞白血病45例免疫表型分析

目的分析慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的免疫表型特点及其与临床特征的关系。方法采用流式细胞术检测45例CLL患者外周血或骨髓CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、FMC7、CD38及ζ链相关蛋白70(ZAP-70)的表达。结果45例患者CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD38和ZAP-70阳性表达率分别为91.1%、100%、100%、73.3%、93.3%、35.6%和40.0%;ZAP-70+CD38+/ZAP-70-CD38-阳性表达率高于ZAP-70+CD38-/ZAP-70-CD38+(80.0%vs.20.0%)(P<0.05)。ZAP-70、CD38表达与Binet分期、化疗有效率具有显著相关性(P<0.01)。结论 ZAP-70和CD38表达是CLL预后判断的重要指标。