草莓ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近。原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达。用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花>红果>粉红果>白果>青果>叶。

小麦ζ-胡萝卜素脱氢酶cDNA全序列的克隆

目的:从普通小麦品种EM12中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)基因的cDNA全长序列。方法:根据已报道的EST序列,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,对EST两端未知序列进行扩增、克隆和测序。结果:克隆得到cDNA全长序列2150bp,其ORF序列为1707bp,预测编码568个氨基酸残基,推测蛋白质分子量62.5kDa,带有一段19aa的信号肽序列。结论:根据同源序列分析,该序列与水稻ZDS蛋白的同源性为97%,与玉米ZDS蛋白的同源性为91%,而且与其他高等植物的ZDS都具有较高的同源性。该基因序列的分离与克隆为进一步开展小麦β-胡萝卜素生物合成机制的研究和利用转基因技术提高小麦β-胡萝卜素含量的研究奠定了基础。

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了Nt ZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析Nt ZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析Nt ZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:Nt ZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。Nt ZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum cul.Jiucaiping2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。

柿ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与序列分析

通过对柿ζ-胡萝卜素脱氢酶(-ζCarotene desaturase,ZDS)基因的克隆及序列分析,旨在为改良柿果实品质奠定基础。根据GenBank中其他植物ZDS基因的保守序列设计了两条PCR扩增引物,以柿果实中所提取的RNA为模板,采用RACE技术扩增出一条约为500bp的条带。经过序列分析,其长578bp,不含内含子,具有部分开放阅读框(177bp)、终止密码子(TGA)和poly(A)尾巴(11bp),共编码58个氨基酸。该序列及其所编码的氨基酸与其他植物ζ-胡萝卜素脱氢酶基因均具有较高的同源性。该基因已提交GenBank数据库,登录号为GU075728。

观赏向日葵ζ-胡萝卜素脱氢酶基因HaZDS的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从观赏向日葵新品种闽葵3号黄色花瓣中克隆获得类胡萝卜素合成途径关键酶基因ZDS,命名为Ha ZDS(Gen Bank No.KF263657),该基因c DNA全长2069 bp,具有一个1761 bp的完整开放阅读框(ORF),编码587个氨基酸。推导氨基酸序列分析表明,Ha ZDS蛋白在N-末端区域含有一个叶绿体转运肽序列,含有一个典型的氨基氧化酶结构域和NAD(P)结合结构域,存在一个特征序列。系统发育分析表明,观赏向日葵Ha ZDS与万寿菊、菊花蛋白的同源性分别达96.4%、90.1%,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,Ha ZDS基因在盛花期表达量最高,不同组织中的表达量舌状花瓣>绿色管状花>苞片>叶片>黑色管状花,随着花瓣黄色的加深,基因表达量逐渐增加。推测Ha ZDS基因在转录水平上参与观赏向日葵花色形成的调控。

番木瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因时空表达的荧光定量PCR分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)是类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶之一,它催化ζ-胡萝卜素转化成链孢红素,并催化链孢红素向番茄红素的转化。ZDS是限速酶,在植物果实颜色和花色发育过程中起着重要作用。本研究以番木瓜黄果品种Dwarf solo和红果品种Sunrise solo为材料,采用实时荧光定量PCR SYBR GreenI荧光染料法,对2个番木瓜品种的不同组织器官及果实发育成熟过程中的ZDS基因在转录水平上的表达进行了相对定量分析。结果表明,2个番木瓜品种的果实、花、叶片中均可检测到ZDS基因在转录水平上的表达,但表达量存在组织和部位上的差异。ZDS基因在成熟果实中的表达量比花中的高,花中的比叶中的高。ZDS基因在Sunrisesolo(红果肉)番木瓜果实发育成熟过程中的表达逐渐增强,且变化显著,而在Dwarf solo(黄果肉)番木瓜果实早期表达增强,成熟后期则表达趋为稳定。2个番木瓜品种成熟果肉中ZDS基因表达量存在差异,红果肉中的表达量高于黄果肉。

黄瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

以西双版纳黄瓜为试材，从黄瓜果肉中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）基因的cDNA序列，命名为CsZds。获得目的片段长度为1805bp，该序列具有完整的开放阅读框，位于31～1761bp，编码576个氨基酸。序列比对分析结果显示，该蛋白在氨基端变化十分明显，中部较为保守，存在一个特征序列。系统进化分析表明，推测的CsZDS蛋白与南瓜中ZDS蛋白同源性最高，达到91．84％。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示，随着果实成熟期的延长，西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量呈明显上升的趋势，在转色期达到最大。在果实发育过程中，西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量高于普通黄瓜。

桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

【目的】克隆桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(Pp ZDS)的全长序列,并对其进行生物信息学及表达分析,为研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理提供参考。【方法】从黄肉品种桃果实中克隆Pp ZDS基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测其在桃果实不同成熟期的表达情况。【结果】克隆获得的Pp ZDS基因全长2014 bp,具有完整的编码区,长度为1716 bp,编码571个氨基酸。Pp ZDS蛋白含有ZDS特征序列(KVAIIGAGLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR),属于NAD_binding_8超级家族保守结构域。Pp ZDS蛋白与同为蔷薇目的苹果(gi|33313474)和草莓(gi|256041892)的ZDS蛋白亲缘关系较近,物种间分化程度较小。整个桃果实成熟期Pp ZDS基因在果肉和果皮中均有表达,从软核期至硬熟期均呈逐渐升高趋势,硬熟期达最高,完熟期降低;不同桃果实发育期果肉中的Pp ZDS基因表达量均大于果皮中表达量,其中硬核期、硬熟期和完熟期的桃果实中Pp ZDS基因在果肉中的表达量显著高于果皮中的表达量(P<0.05)。【结论】Pp ZDS基因表达对桃果实类胡萝卜素生物合成及呈色发挥正向调控作用。

巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。根据实验室已获得的巴氏杜氏藻ZDS基因的cDNA序列,设计引物,通过分段PCR的方法,获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列,利用染色体步移的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对获得序列进行分析。实验获得的完整ZDS基因全长11896 bp,其中编码区序列(从"ATG"到"TAA")长度为6435,编码区上游序列4091 bp(包括33 bp的5’UTR序列),编码区下游序列1370 bp(包括411 bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA(开放阅读框)进行比对,发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子,其中内含子长度达4686 bp,约为外显子长度的2.68倍,内含子均以GT开始,AG收尾,属于最常见的内含子类型。通过生物信息学分,发现ZDS启动子中具有多种转录因子结合位点,包括与光调控有关的GAGAbox,ASF1;与植物黄化反应有光的ACGTbox等。

马铃薯PDS和ZDS基因的克隆与表达特性分析

八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)和ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase)是类胡萝卜素合成通路上的关键限速酶,影响植物体内类胡萝卜素的合成。为解析PDS和ZDS在马铃薯类胡萝卜素合成途径中的作用,为马铃薯类胡萝卜素合成的分子调控机理解析和新品种创制奠定基础,研究从黄心马铃薯晋薯16号品种中克隆PDS和ZDS基因,利用生物信息学工具对这2个基因及其所编码的蛋白序列进行分析,并对二者在不同组织内的表达模式进行定量检测。结果表明,克隆得到PDS和ZDS基因长度分别为1 752、1 767 bp,分别编码583、588个氨基酸;StPDS的分子质量为64.97 ku,理论等电点为6.41;StZDS的分子质量为64.73 ku,理论等电点8.51;PDS和ZDS均属于亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析表明,马铃薯晋薯16号的PDS和ZDS分别与番茄PDS和ZDS的同源性最高。通过测定3个不同马铃薯品种晋薯16号、红玫瑰2号和希森8号叶片和薯块中的类胡萝卜素含量,发现在同一组织中,红玫瑰2号的类胡萝卜素含量显著高于希森8号和晋薯16号,这一结果说明,StPDS和StZDS基因可能正向调控马铃薯块茎类胡萝卜素的积累;在同一品种中,类胡萝卜素含量较少的叶片中StPDS和StZDS基因表达量却远远高于块茎中基因的表达量,推测这2个基因可能参与叶片的光合作用。

利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑青花菜BoZDS

胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)是类胡萝卜素合成的限速酶。本试验以青花菜多代自交系‘ZN09’为试材,以BoZDS为目标基因,在其第1个外显子上选取2个靶位点,分别构建CRISPR/Cas9载体进行稳定遗传转化。1号靶位点转化效率为0.80%,突变率为15.79%,共获得3株突变体,均为杂合突变;2号靶位点转化效率为0.84%,突变率为36.84%,共获得7株突变体,其中纯合突变2株,杂合突变2株,嵌合突变3株。突变体均出现白化或斑驳表型,突变体L*值和a*值均显著高于野生型植株,b*值均下降。本试验建立了青花菜CRISPR/Cas9基因编辑稳定遗传体系,并对BoZDS基因进行有效编辑,研究结果为利用基因编辑技术进行青花菜基因功能研究与优异性状材料创制提供了技术支撑。

胡萝卜DcZDS基因的克隆和表达分析

以黄色胡萝卜‘黄珊瑚’(19071)、橙色胡萝卜‘新黑田五寸’(C1)、红色胡萝卜‘玫瑰红’(17106)为试材,采用生物信息学方法,研究了3个品种胡萝卜克隆得到的DcZDS基因编码的氨基酸组成和理化性质及其肉质根在不同发育阶段DcZDS基因的相对表达量,以期为DcZDS基因对番茄红素合成的影响提供参考依据。结果表明:3个品种胡萝卜DcZDS基因的cDNA全长均为1722 bp,编码573个氨基酸;DcZDS基因编码蛋白的理化性质基本相同,均属于亲水性且不稳定的蛋白;编码蛋白的二级结构主要包含α-螺旋和无规则卷曲,且主要在叶绿体中发挥作用,是一种非分泌性蛋白;系统进化树分析发现,胡萝卜DcZDS基因与芹菜DcZDS的亲缘关系最近。在肉质根发育的不同时期DcZDS基因的表达量均呈现先升高后降低的模式,但在肉质根发育的65 d时,DcZDS在红色肉质根中的表达量显著高于橙色和黄色肉质根,说明DcZDS的高表达促进了番茄红素在红色胡萝卜中的积累。

漳州水仙ZDS基因cDNA克隆及其表达分析

采用RACE技术从漳州水仙‘金盏银台’Narcissus tazetta var.chinensis花器官总RNA中克隆ZDS的cDNA序列,用相关软件进行序列分析,并利用实时荧光定量技术检测ZDS基因在各水仙品种不同花器官的表达。序列分析表明,ZDS基因cDNA全长2189 bp,其中包含69 bp 5'非编码区,395 bp 3'非编码区,1725 bp编码区(编码574个氨基酸,分子量约63.6 kDa),命名为Ntzds(GenBank登录号:EU573238),其编码的氨基酸序列(ACB87206.1)与喇叭水仙(CAA12062.1)、葡萄(XP_002277348.21)和温州蜜柑(ABC33728.1)ZDS基因编码产物的相似性分别为97%、85%和83%。实时荧光定量PCR分析表明,Ntzds基因在漳州水仙‘金盏银台’、‘Minnow’、‘Fortissimo’中均有表达,且同一品种中副冠的表达量高于花瓣;随着花色的加深,其转录水平也逐渐趋高。

利用CRISPR/Ca9技术靶向编辑芥蓝BoaZDS

以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。