κ-卡拉胶寡糖的酶解制备及其体外抗病毒活性

利用Pseudoalterom onassp.AJ5-13菌株所产生的κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶制备κ-卡拉胶寡糖,通过电喷雾离子化飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)和核磁共振波谱(13C-NMR)分析,该酶的水解产物主要是硫酸κ-新卡拉二糖、硫酸κ-新卡拉四糖、硫酸κ-新卡拉六糖、硫酸κ-新卡拉八糖和硫酸κ-新卡拉十糖,确定该κ-卡拉胶酶专门水解κ-卡拉胶3,6-内醚-D-半乳糖和4-硫酸-D-半乳糖之间的β-1,4糖苷键,产生3,6-内醚-D-半乳糖作为非还原端,D-半乳糖作为还原端的κ-新卡拉寡糖。采用体外Vero细胞培养法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法研究了寡糖抗标准单纯疱疹病毒1型(HSV-1)活性。结果表明,κ-新卡拉寡糖对Vero细胞毒性极低,可干扰HSV-1毒株向Vero细胞的吸附。

κ-卡拉胶寡糖硫酸基含量与其抗疱疹病毒活性的关系

利用酶解法降解κ-卡拉胶,得到κ-卡拉胶寡糖(KOS)。利用甲酰胺-氯磺酸和二甲基亚砜-甲醇-吡啶方法,分别得到κ-卡拉胶寡糖磺化衍生物(SKO)和κ-卡拉胶寡糖脱硫酸基衍生物(DSK)。利用单纯疱疹病毒HSV-1研究了κ-卡拉胶寡糖硫酸基含量与抗病毒活性之间的关系,同时从对病毒的直接作用、阻止病毒对细胞的吸附和影响病毒复制与释放3个途径初步探讨了κ-卡拉胶寡糖抗疱疹病毒的机理。结果表明,KOS及SKO对Vero细胞毒性极低,对单纯疱疹病毒HSV-1无直接灭活作用,也不影响病毒的复制和释放,但是能够阻止病毒对细胞的吸附。相同浓度下,SKO对病毒吸附的抑制率要明显高于KOS,DSK对病毒则无明显作用。实验说明,κ-卡拉胶寡糖硫酸基含量与其抗疱疹病毒活性二者呈正相关,而且κ-卡拉胶寡糖及其磺化衍生物的抗病毒活性主要是通过阻止病毒对细胞的吸附而实现。

κ-卡拉胶寡糖对仿刺参溶菌酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响

采用10 g/L的两种κ-卡拉胶寡糖对仿刺参Apostichopus japonicus进行体壁注射刺激后,测定其体腔液中溶菌酶(LSZ)、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的动力学变化。结果表明:在注射κ-卡拉胶寡糖后的第1天,1、2号寡糖组的LSZ活性达到最高,分别是对照组的7.0和6.0倍,极显著高于对照组(P<0.01);AKP活性于注射后第2天增至最高,1、2号寡糖组的酶活性分别是对照组的1.9和2.6倍,前3天试验组的酶活性显著高于对照组(P<0.05);1号寡糖组的SOD活性于注射后第2天达到最高,然后逐渐下降,而2号寡糖组的酶活性第2天呈现增加,第5天达到最高,1、2号寡糖组的酶活性最高时分别是对照组的2.0倍和2.3倍,且极显著高于对照组(P<0.01)。非参数检验分析表明,1、2号寡糖组3种酶活性变化趋势与对照组差异极显著(P<0.01),说明κ-卡拉胶寡糖具有增强仿刺参免疫活性的作用。

κ-卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分析方法研究

采用高效毛细管电泳法(HPCE)对κ-卡拉胶寡糖的8-氨基萘基-1,3,6-三磺酸(ANTS)衍生物进行了分离分析,考察了缓冲液浓度、pH、电压等参数对寡糖衍生物分离的影响。实验结果表明,在含有15 mmol/L三乙胺的25 mmol/L柠檬酸钠缓冲液中,当pH=2.8,运行电压为25 KV,电泳由正极到负极,温度28℃,检测波长235 nm时,κ-卡拉胶寡糖获得了高效分离。并将该方法应用于κ-卡拉胶酸水解过程中产生的寡糖的分析。

κ-卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响

目的研究κ-卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响。方法原代培养小鼠皮肤成纤维细胞,传代培养后加入不同浓度的κ-卡拉胶寡糖作用,应用细胞计数法,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,检测κ-卡拉胶寡糖对皮肤成纤维细胞增殖的影响,ELISA法检测κ-卡拉胶寡糖对皮肤成纤维细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的影响。结果 12.5μg/mL 100μg/mL范围内,各组κ-卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞均有一定促进增殖作用,其中以100μg/mL时最为显著(P<0.01)。用25μg/mL和50μg/mLκ-卡拉胶寡糖处理小鼠皮肤成纤维细胞后,与对照组相比,Ⅰ型胶原蛋白分泌明显增加(P<0.05);12.5μg/mL 100μg/mL范围内,各组κ-卡拉胶寡糖均显著促进Ⅲ型胶原蛋白分泌(P<0.05)。结论κ-卡拉胶寡糖能有效促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌。

κ-卡拉胶寡糖脂的合成及其结构鉴定

以κ-卡拉胶为原料,通过稀酸降解并结合柱层析分离得到5个寡糖单体,经还原胺化法将其与二棕榈酸酯磷脂酰乙醇胺(DPPE)偶联首次获得了5个拟糖脂.应用高灵敏电喷雾离子化碰撞诱导解离串联质谱(ESI-CID-MS/MS)技术确定了其序列,证明其分别为κ-卡拉胶三糖脂、五糖脂、七糖脂、九糖脂和十一糖脂.该研究结果为硫酸寡糖脂的合成提供了参考方法,尤其为寡糖生物芯片的制备以及深入开展寡糖与蛋白相互作用研究提供了基础.

κ-卡拉胶寡糖AEC柱前衍生物的LC-ESI-MS/MS^n分离分析

以κ-卡拉胶为原料,经盐酸水解得到一系列寡糖混合物.以3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole,AEC)为衍生化试剂,对酸解得到的κ-卡拉胶寡糖进行柱前衍生,采用反相C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈和乙酸铵水溶液(pH 4.5)为流动相,梯度洗脱,在254 nm波长处检测,建立了κ-卡拉胶寡糖衍生物的高效液相色谱(HPLC)分离以及液相色谱-电喷雾质谱联用(LC-ESI-MS)分离分析的方法,并对AEC衍生后的κ-卡拉胶寡糖进行多级质谱裂解(MSn),进一步获得了κ-卡拉胶寡糖的结构信息.该方法对κ-卡拉胶寡糖的结构分析、构效关系等方面的研究有参考价值.

κ-卡拉胶寡糖为配体的亲和探针制备方法的研究

目的:建立一种以κ-卡拉胶寡糖为配体,Affi-gel15为载体的亲和探针,用于分离纯化κ-卡拉胶寡糖在细胞信号通路中的特异性受体。方法:将标准寡糖和κ-卡拉胶寡糖进行己二胺衍生化后与Affi-gel15结合,并利用MS、NMR、PAGE电泳等方法对各步的产物进行分析。结果:MS、NMR结果表明,标准寡糖和κ-卡拉胶寡糖均能与己二胺进行完全稳定的衍生化反应,其衍生物与Affi-gel15的结合率都能达到50%以上,其中κ-卡拉胶寡糖-己二胺与Affi-gel15的结合率达到了68%。结论:制备得到的以κ-卡拉胶寡糖为配体的亲和探针能够与κ-卡拉胶寡糖的受体结合,如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。这表明这种制备方法是可行的。

假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的酶解工艺优化及产物分析

为探索假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的酶解工艺,以κ-卡拉胶为底物,还原糖生成量为评价指标,对酶解工艺进行优化。采用3,5-二硝基水杨酸法和苯酚-硫酸法分别测定还原糖和总糖含量,计算酶解产物的平均聚合度,并利用质谱鉴定酶解产物。结果显示,假交替单胞菌κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶的优化工艺条件为:加酶量为0.35 U(反应体系5 mL),反应温度为40℃,反应pH=8.0,κ-卡拉胶底物质量浓度为9 g/L。在此条件下,酶解反应240 min后产生的还原糖质量浓度为1.531 g/L,酶解产物的平均聚合度为2。该κ-卡拉胶酶酶解反应的K=2.07 g/L,V=7.25 U/mg。质谱分析显示,假交替单胞菌κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶的产物为κ-卡拉胶二糖和κ-卡拉胶四糖。