荷斯坦牛κ-酪蛋白基因分型KASP检测方法的建立与应用

为筛选κ-酪蛋白优势基因型,本研究设计4个SNP位点,利用基因组检测已知CSN3基因型的13头牛,采集抗凝血,提取基因组DNA,采用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)对样本进行分型,CSN3基因有AA、BB、EE、AB、AE、BE六种基因型。本研究实现了对北京地区213头荷斯坦种公牛及1003头母牛中CSN3三种常见变异体的全面筛选,从育种角度出发,基于κ-酪蛋白不同基因型与奶酪生产的产量和质量相关性,利用分子检测方法筛选与优良性状的优势基因型,发掘荷斯坦牛特色优质种质资源,为牧场选择合适的荷斯坦牛,提高乳蛋白率,从种源解决相关领域的技术瓶颈。

中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白可变剪切及蛋白突变类型的研究

【目的】κ-酪蛋白蛋白突变与奶牛生产性能和乳品加工性能关系密切,监控中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白的蛋白突变,可以防止对生产不利的突变的发生。【方法】以50头不同泌乳期的中国荷斯坦奶牛为研究对象,获取每头奶牛乳中的体细胞,提取RNA,反转录为cDNA,设计不同引物,分别扩增κ-酪蛋白可变剪切体序列和CDS序列,并进行测序、蛋白突变分析、突变蛋白的磷酸化、糖基化分析。【结果】测序结果表明在不同泌乳期中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白只存在Ensemble数据库中公布的573 bp的剪切形式,不存在另一种剪切体。κ-酪蛋白的CDS区存在三处碱基突变,即c.536T>C、c.572C>A、c.633G>A,形成的蛋白突变型只有A型和B型两种。A型与B型相比,A型多了两个磷酸化位点(136位和142位)和一个O型糖基化位点(157位)。【结论】不同泌乳期的中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白只存在573 bp的剪切体,蛋白突变型只存在A型和B型,未检测到其它突变型,依据生产目的不同,可对A型奶牛与B型奶牛进行筛选。

中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白基因第四外显子多态性与产奶性状的关联分析

以544头中国荷斯坦奶牛为研究对象,以κ-酪蛋白基因为产奶性状的候选基因,扩增779bp的片段,结合测序结果采用PCR-RFLP方法来检测κ-酪蛋白基因3个位点的多态性。结果在exon4的第10891bp、10927bp和10988bp处分别发生了T/C、C/A错义突变和G/A同义突变,据此分别选择了TaqⅠ、HindⅢ、PstⅠ等3种限制性内切酶检测了其多态性。发现3个位点的A、B等位基因在群体中都有分布,且处于低度多态;A和B等位基因的频率分别为86.03%和13.97%;AA,AB和BB基因型频率分别为73.71%,24.63%和1.66%;χ2适合性检验表明,该群体在这3个位点的突变达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);BB和AB基因型个体乳脂率显著高于AA基因型个体(P<0.05),AB基因型个体脂蛋白比显著高于AA基因型个体(P<0.05),但不同基因型对产奶量和乳蛋白率没有显著影响;3个位点的酶切多态性在所研究群体中是紧密连锁的。说明在中国荷斯坦奶牛群体中,κ-酪蛋白B等位基因可作为改良奶牛乳脂率性状的分子遗传标记。

精氨酸水平对奶牛乳腺上皮细胞体外生长及κ-酪蛋白基因表达的影响

本试验旨在研究培养基中添加不同浓度的精氨酸(Arg)对乳腺上皮细胞体外增殖及κ-酪蛋白(CSN3)基因表达的影响。选用中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养,以无Arg的培养基(0.00 mg/L)为对照(0组),试验培养基分别添加69.50(0.25组)、139.00(0.50组)、278.00(1.00组)、556.00(2.00组)、1 112.00(4.00组)和2 224.00 mg/L(8.00组)的精氨酸。结果表明:Arg能促进乳腺上皮细胞的增殖,24 h时,0.25～4.00组与0组相比均差异显著(P<0.05),8.00组与0组相比差异不显著(P>0.05);48和72 h时,各试验组与0组相比均差异显著(P<0.05)。Arg能促进CSN3基因的表达,各试验组与0组相比均差异显著(P<0.05),当Arg浓度为556.00 mg/L时,CSN3基因表达量最高。结果提示,Arg对乳腺上皮细胞增殖及CSN3基因表达均具有明显的促进作用,且在Arg浓度为69.50～1 112.00 mg/L时促细胞增殖效果较佳,在Arg浓度为556.00 mg/L时促CSN3基因表达作用最强。

中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因第4和第5外显子多态性与泌乳性状的关联分析

【目的】研究中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因第4和第5外显子多态性与泌乳性状的关联性,为培育高乳蛋白及高乳脂率奶牛提供参考依据。【方法】采用DNA测序、PCR-RFLP和CRS-PCR技术,对544头中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因的外显子4和5序列进行研究,通过SHEsis软件和PHASE软件进行配对连锁不平衡分析和单倍型分析。【结果】发现6个新的SNPs,包括外显子5上A12907G、G12950A、C12989T、A13028G、T12980C共5个SNP位点,证实前4个位点紧密连锁;外显子4上A10996T共1个SNP位点。单位点基因型与泌乳性状关联分析表明,A10996T突变位点的TT和AT基因型个体乳脂率显著高于AA基因型个体(P<0.05);T12980C突变位点的TC和CC基因型个体乳脂率、乳蛋白率分别极显著(P<0.01)、显著(P<0.05)高于TT基因型个体;紧密连锁的4个突变位点的DE基因型个体乳脂率极显著高于DD基因型个体(P<0.01)。与泌乳性状的关联分析表明,共构建出7种单倍型,发现16种单倍型组合;其中H6H6单倍型组合个体乳脂率最高,H1H4次之;H1H4单倍型组合个体乳蛋白率最高;H5H6单倍型组合个体乳蛋白率及乳脂率最低。【结论】H1H4单倍型组合在乳蛋白率和乳脂率方面为有利单倍型组合,可作为选择高乳蛋白高乳脂率牛群的分子标记。

胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞生长及κ-酪蛋白和胰岛素受体基因表达的影响

本试验旨在研究培养基中添加不同浓度的胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞生长及κ-酪蛋白(CSN3)和胰岛素受体(INSR)基因表达的影响。选用中国荷斯坦奶牛的乳腺上皮细胞进行体外培养,在以无血清无激素的生长培养基为对照的基础上,分别添加胰岛素5、50、500和5 000 ng/mL,测定CSN3和INSR基因表达量以及CSN3相对含量的变化。结果表明:1)胰岛素能够促进乳腺上皮细胞的增殖,其中5～500 ng/mL的胰岛素促增殖作用较好。2)胰岛素能提高乳腺上皮细胞CSN3、INSR基因表达量和CSN3相对含量,50 ng/mL组CSN3基因表达量和CSN3相对含量均显著或极显著高于对照组(P<0.01)以及5(P<0.01)、500(P<0.01)和5 000 ng/mL组(P<0.05),INSR基因表达量显著或极显著高于对照组(P<0.05)以及500(P<0.05)和5 000 ng/mL组(P<0.01)。结果提示,随着胰岛素浓度的增加,CSN3和INSR基因的表达量及CSN3相对含量均呈先增加后下降的趋势,50 ng/mL时最高,而高浓度(5 000 ng/mL)的胰岛素不利于奶牛乳腺上皮细胞合成乳蛋白。

亮氨酸水平对奶牛乳腺上皮细胞增殖及κ-酪蛋白合成相关基因表达的影响

本试验旨在研究添加不同水平亮氨酸对乳腺上皮细胞体外增殖及κ-酪蛋白(CSN3)合成相关基因表达的影响。选用中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养,以不含有亮氨酸的培养基为对照组(0×组),试验组培养基分别添加0.112 5(0.25×组)、0.225 0(0.5×组)、0.450 0(1×组)、0.900 0(2×组)、1.800 0(4×组)、3.600 0(8×组)、7.200 0(16×组)、14.400 0 mmol/L(32×组)的亮氨酸。试验采用噻唑蓝(MTT)比色法检测奶牛乳腺上皮细胞增殖;运用实时定量PCR检测CSN3合成相关基因相对表达量。结果表明:亮氨酸能够提高乳腺上皮细胞的相对增殖率。24和48 h时,除0.25×组外,其余各组与对照组相比细胞均差异均显著(P<0.05);72 h时,各组与对照组相比差异均显著(P<0.05);其中2×组的促增殖作用都达到最强。亮氨酸能够促进哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)、转录激活因子5(STAT5)和CSN3基因的表达,抑制真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)基因的表达,其中2×组对m TOR、S6K1、JAK2、STAT5和CSN3基因的上调表达最强,而对4EBP1基因的下调表达最强。总之,添加亮氨酸能够促进奶牛乳腺上皮细胞增殖和CSN3合成相关基因(除4EBP1)表达,亮氨酸水平为0.900 0 mmol/L时,其促进作用均达到最大。

天祝白牦牛α_(S1)-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。

通过测序与预测分析靶向奶牛乳腺κ-酪蛋白的miRNA

本研究旨在验证通过测序与预测分析靶向奶牛乳腺κ-酪蛋白(CSN3)的miRNA。应用乳腺组织的小RNA测序、TargetScan预测和RNAhybrid分析,筛选了4个可能靶向CSN3的miRNA,分别是bta-miR-33a、bta-miR-2284ab、bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p。接着,通过荧光素酶报告试验检测CSN3-3’非编码区(3’ UTR)和4种miRNA的结合情况,结果表明只有bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p能与CSN3-3’UTR结合(P<0.01)。牛奶体细胞相关基因表达趋势进一步验证了bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p与CSN3的靶向关系。这些结果提示,bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p可直接靶向CSN3,这可以解释从泌乳高峰期至泌乳后期牛奶中CSN3蛋白总量的减少。本试验结果为乳蛋白的调控研究提供了依据,并为miRNA的功能研究铺垫了道路。

水牛κ-酪蛋白基因(CSN3)外显子4序列多态性研究

分别设计位于CSN3 5个外显子旁侧引物,采用DNA测序法对沼泽型和河流型水牛CSN3编码区结构进行了分析,并对10个水牛群体共106个样本CSN3第4外显子序列进行了变异检测。结果表明,两类水牛CSN3编码区由848个核苷酸组成,包括ORF序列573bp、5′-UTR序列69bp和3′-UTR序列206bp。在水牛CSN3第4外显子中共检测到4个SNP,其中c.445G>A,c.467C>T和c.516A>C为异义替换,导致相应的κ-CN成熟肽中氨基酸发生p.Val128Ile、p.Thr135Ile和p.Glu151Asp改变,c.467C>T和c.516A>C替换可能对κ-CN功能产生了影响。群体遗传分析表明,在河流型水牛中,等位基因c.445G、c.467C、c.471C和c.516A均为优势等位基因,而在沼泽型水牛中,仅c.445G、c.467C和c.471C为优势等位基因,河流型和沼泽型水牛的遗传差异主要体现在SNP516位点的群体遗传组成上。

两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量检测研究

分别以免血清IgG与鸡卵黄抗体（IgY）为检测抗体,建立了两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量方法.牛乳κ-酪蛋白分别免疫新西兰大白兔和临产母鸡,经亲和层析分离纯化后得到anti-κ-CN-IgG与anti-κ-CN-IgY两种抗体.两种抗体均与β-酪蛋白、α-乳白蛋白和乳清粉存在一定交叉反应,抗体与相应抗原进行免疫吸收后得到高特异性IgG与IgY.用吸收后的anti-κ-CN-IgG建立的间接ELISA法,当标准κ-CN质量浓度在0.098～3.125 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度具有线性关系,变异系数小于1％,回收率在99.10％～101.1％之间；用吸收后的anti-κ-CN-IgY检测κ-CN,在0.098～6.25 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度成良好的线性关系,变异系数小于2％,回收率在98％～100.8％之间.当三聚氰胺掺假量在0～20％时,两种抗体均能通过κ-CN的定量检测而实现乳品的掺假检验.

κ-酪蛋白基因及其功能研究进展

κ-酪蛋白(kappa-casein,-κCN)是牛乳中的一种重要的蛋白质。作者简要介绍了κ-酪蛋白基因的结构、遗传多态性与产奶性状的关系及其编码蛋白质的生物学功能等方面的研究进展。

草原红牛κ-酪蛋白基因的多态性及与泌乳性状关联性分析

为研究草原红牛κ-酪蛋白基因的多态性及与泌乳性状相关性,采用PCR-RFLP方法检测κ-酪蛋白基因外显子5的遗传多态性。结果检测到TT、TC和CC三种基因型,统计分析表明,此多态位点与草原红牛乳蛋白和乳糖呈显著相关,乳蛋白:CC基因型极显著高于CT基因型和TT基因型(P<0.01),而CT基因型也极显著高于TT基因型(P<0.01)。乳糖:TT基因型和TC基因型极显著高于CC基因型(P<0.01),而TT和TC基因型之间差异不显著(P>0.01)。其他泌乳性状的基因型间差异不显著(P>0.01)。结果表明,κ-CN基因对草原红牛乳蛋白和乳糖具有较大的遗传效应,可初步推断κ-CN是控制这一性状的众多基因之一,是影响草原红牛乳蛋白和乳糖的一个主效基因或与主效基因相连锁,可作为选育草原红牛高乳蛋白及低乳糖奶牛的分子标记,用于标记辅助选择意义重大。

牦牛κ-酪蛋白新遗传变异体及进化分析

为明确牦牛乳中κ-酪蛋白中遗传多样性,以κ-酪蛋白基因(CSN3)的IV外显子为研究对象,采用PCR-RFLP方法对麦洼牦牛的CSN3进行分析,旨在从分子水平揭示κ-酪蛋白在牦牛乳中遗传多样性分布.并以CSN3的IV外显子序列建立牛属κ-酪蛋白的系统发育树,从而分析进化关系.结果表明,牦牛乳中κ-酪蛋白多数以纯合体形式存在,并发现了一个新的变异体GU441771.牛属CSN3的系统发育树分析表明,κ-酪蛋白在进化上存在一定的物种特异性.

牛乳κ-酪蛋白活性多肽及其改造肽的合成和生物活性

为获得抗凝血活性更强的多肽,对牛乳κ-酪蛋白(κ-CN)的十一肽(f106-116)进行设计合成并改造,采用Fmoc固相合成策略,以Wang树脂为载体,Fmoc保护氨基酸为原料,HOBT/DIC为缩合剂,TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚裂解体系脱除保护基,经RP-HPLC纯化后得到了纯度>95%的9种多肽,经ESI-MS确证其结构。将所有的合成肽进行凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)以及凝血酶原时间(PT)活性测定,结果表明,各改造肽抗凝活性皆低于十一肽,增强牛乳κ-CN的十一肽片段的疏水性,其TT活性增强。

傅里叶变换红外光谱的牛乳中α_(s)1-酪蛋白和κ-酪蛋白含量的快速检测

为了找到一种能够对牛乳中的两种主要过敏原(αs1和κ-酪蛋白)含量快速检测的方法,以河南、湖北、宁夏和内蒙古四省区的211份中国荷斯坦牛牛乳样本为研究对象,建立了基于傅里叶变换中红外光谱技术的牛乳中αs1和κ-酪蛋白含量的无损快速检测模型。首先对牛乳的原始光谱进行预分析,发现水对牛乳的光谱吸收具有很强的干扰,对水的两个主要吸收区域1597~1712和3024~3680 cm^(-1)进行分析,发现水的吸收区域1597~1712 cm^(-1)和蛋白的部分吸收区域1558~1705 cm^(-1)(酰胺Ⅰ)基本重合,通过对比去除1597~1712 cm^(-1)前后的效果,最终选择925.92~3005.382 cm^(-1)的光谱区域作为敏感波段用于后续分析。选取的全光谱经手动降维,利用MCCV剔除异常样本,分别采用标准正态变量变换(SNV)、多元散射校正(MSC)等8种预处理算法和竞争性自适应重加权算法(CARS)、无信息变量消除法(UVE)等3种特征选择算法联合建立支持向量机回归模型(SVR)。经检验,对于αs1-酪蛋白,一阶导数和CARS算法结合建立的SVR模型效果最优,训练集相关系数Rc和测试集相关系数R p分别为0.8827和0.8998,训练集均方根误差RMSEC和测试集均方根误差RMSEP分别为1.1363和1.3726;对于κ-酪蛋白,一阶差分和UVE算法结合建立的SVR模型效果最优,训练集相关系数R_(c)和测试集相关系数R_(p)分别为0.8808和0.8903,训练集均方根误差RMSEC和测试集均方根误差RMSEP分别为0.5345和0.5354。研究结果表明,基于傅里叶变换中红外光谱技术建立的SVR模型可以对牛乳中的过敏原α_(s)1和κ-酪蛋白含量进行无损检测,预测效果良好,此研究弥补了国内利用光谱技术对牛乳中的酪蛋白进行无损快速检测的空白。

κ-酪蛋白多态性对水牛乳酪蛋白体外消化性及消化产物生物活性的影响

为研究κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)多态性对水牛乳酪蛋白消化特性的影响,以水牛乳κ-CN多态性为依据,对不同κ-CN亚型的水牛乳酪蛋白进行体外模拟胃肠消化,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和邻苯二甲醛(OPA)水解度法分析其在消化过程中的情况,测定消化产物的抗氧化活性和血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。结果表明:水牛乳κ-CN存在AA、BB、AB、AC 4种亚型,不同κ-CN亚型的水牛乳酪蛋白的体外消化性存在差异,AB型酪蛋白消化水解最快,其次为BB型,AB型与AC型消化速度相近;不同κ-CN亚型的水牛乳酪蛋白消化产物具有一定的抗氧化性和ACE抑制活性。各κ-CN亚型的酪蛋白消化产物对ABTS自由基清除能力差别不大;BB、AA、AB型的亚铁螯合力相当,高于AC型;羟基自由基清除能力最高的是AC型;AA、AC型对ACE抑制活性高于AB、BB型。

GLGI技术鉴定奶山羊乳腺中的κ-酪蛋白基因

采用GLGI技术扩增本实验室构建的Long-SAGE标签库中的κ-酪蛋白基因。使用SMARTTM RACE cDNA Ampliication Kit通过RT-PCR把奶山羊乳腺组织中的mRNA逆转录成cDNA,分别用3’RACE和5’RACE扩增κ-酪蛋白基因的3’端和5’端。扩增产物经TA克隆后转化大肠杆菌,随机挑取阳性克隆后进行测序分析。通过序列比对、拼接,获得全长的κ-酪蛋白基因。应用GLGI技术成功获得了完整的奶山羊乳腺CSN3序列,为CSN3结构分析和功能研究奠定了重要基础。

抗κ-酪蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

试验为制备抗κ-酪蛋白单克隆抗体并对其进行特性鉴定,采用足垫免疫κ-酪蛋白的方法刺激BALB/c小鼠产生免疫应答,将小鼠腘淋巴结细胞与骨髓瘤细胞在PEG诱导下进行融合,通过克隆化培养获得了能稳定分泌抗κ-酪蛋白抗体的杂交瘤细胞株,并利用Protein G亲和层析柱纯化腹水获得了单克隆抗体。试验获得了3株杂交瘤细胞株:1C4、3G3、3E6,所分泌的抗体亚类均为IgG1,其中3G3与3E6抗原识别表位不同,1C4与3E6抗原识别表位相近,1C4株腹水纯化后效价为1.28×106,其亲和力常数为2.89×108 mol/L。试验制备出了亲和力较好的抗κ-酪蛋白单克隆抗体,为牛奶酪蛋白的快速检测奠定了基础。

昌台牦牛κ-酪蛋白基因重复片段多态性的快速检测

分析昌台牦牛κ-酪蛋白基因重复片段多态性.用Chelex-100方法从昌台牦牛(n=100)全乳中提取基因组DNA,利用PCR对κ-酪蛋白基因第四外显子部分片段进行扩增,通过非变性PAGE及银染确定κ-酪蛋白基因重复片段多态性.结果显示昌台牦牛κ-酪蛋白基因重复片段存在A和B两种等位基因,基因频率分别为0.094,0.906,B等位基因包含12 bp的重复片段.AB型个体17个,BB型个体73个.昌台牦牛κ-CN基因重复片段等位基因B为优势等位基因.