体外模拟消化环境中消化酶对κ-卡拉胶/酪蛋白复合体系流变学特性及微观结构的影响

卡拉胶与酪蛋白的结合对肠道屏障具有一定的保护作用,为研究两者在体外消化模拟中消化酶是否是影响多糖或多糖-蛋白复合体系构象转变的主要因素,本文以κ-卡拉胶为研究对象,选择酪蛋白为基质,探究体外模拟消化环境中消化酶对κ-卡拉胶/酪蛋白复合体系结合稳定性的影响。结果表明,消化酶对κ-卡拉胶与酪蛋白的结合影响不大,但可以使体系硫酸基团暴露量显著增加,不利于κ-卡拉胶的构型。体系中的酪蛋白被分解为低分子量的蛋白质或肽段,使得复合体系的特征长度增加,相互作用减弱,粘弹性下降,双螺旋结构稳定性降低。本研究为κ-卡拉胶的安全应用提供了理论依据。

荷斯坦牛κ-酪蛋白基因分型KASP检测方法的建立与应用

为筛选κ-酪蛋白优势基因型,本研究设计4个SNP位点,利用基因组检测已知CSN3基因型的13头牛,采集抗凝血,提取基因组DNA,采用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)对样本进行分型,CSN3基因有AA、BB、EE、AB、AE、BE六种基因型。本研究实现了对北京地区213头荷斯坦种公牛及1003头母牛中CSN3三种常见变异体的全面筛选,从育种角度出发,基于κ-酪蛋白不同基因型与奶酪生产的产量和质量相关性,利用分子检测方法筛选与优良性状的优势基因型,发掘荷斯坦牛特色优质种质资源,为牧场选择合适的荷斯坦牛,提高乳蛋白率,从种源解决相关领域的技术瓶颈。

中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白可变剪切及蛋白突变类型的研究

【目的】κ-酪蛋白蛋白突变与奶牛生产性能和乳品加工性能关系密切,监控中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白的蛋白突变,可以防止对生产不利的突变的发生。【方法】以50头不同泌乳期的中国荷斯坦奶牛为研究对象,获取每头奶牛乳中的体细胞,提取RNA,反转录为cDNA,设计不同引物,分别扩增κ-酪蛋白可变剪切体序列和CDS序列,并进行测序、蛋白突变分析、突变蛋白的磷酸化、糖基化分析。【结果】测序结果表明在不同泌乳期中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白只存在Ensemble数据库中公布的573 bp的剪切形式,不存在另一种剪切体。κ-酪蛋白的CDS区存在三处碱基突变,即c.536T>C、c.572C>A、c.633G>A,形成的蛋白突变型只有A型和B型两种。A型与B型相比,A型多了两个磷酸化位点(136位和142位)和一个O型糖基化位点(157位)。【结论】不同泌乳期的中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白只存在573 bp的剪切体,蛋白突变型只存在A型和B型,未检测到其它突变型,依据生产目的不同,可对A型奶牛与B型奶牛进行筛选。

中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因第4和第5外显子多态性与泌乳性状的关联分析

【目的】研究中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因第4和第5外显子多态性与泌乳性状的关联性,为培育高乳蛋白及高乳脂率奶牛提供参考依据。【方法】采用DNA测序、PCR-RFLP和CRS-PCR技术,对544头中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因的外显子4和5序列进行研究,通过SHEsis软件和PHASE软件进行配对连锁不平衡分析和单倍型分析。【结果】发现6个新的SNPs,包括外显子5上A12907G、G12950A、C12989T、A13028G、T12980C共5个SNP位点,证实前4个位点紧密连锁;外显子4上A10996T共1个SNP位点。单位点基因型与泌乳性状关联分析表明,A10996T突变位点的TT和AT基因型个体乳脂率显著高于AA基因型个体(P<0.05);T12980C突变位点的TC和CC基因型个体乳脂率、乳蛋白率分别极显著(P<0.01)、显著(P<0.05)高于TT基因型个体;紧密连锁的4个突变位点的DE基因型个体乳脂率极显著高于DD基因型个体(P<0.01)。与泌乳性状的关联分析表明,共构建出7种单倍型,发现16种单倍型组合;其中H6H6单倍型组合个体乳脂率最高,H1H4次之;H1H4单倍型组合个体乳蛋白率最高;H5H6单倍型组合个体乳蛋白率及乳脂率最低。【结论】H1H4单倍型组合在乳蛋白率和乳脂率方面为有利单倍型组合,可作为选择高乳蛋白高乳脂率牛群的分子标记。

中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因多态性与产奶量的相关分析

本文利用ＰＣＲＲＦＬＰＳ方法对２６头中国荷斯坦牛κ酪蛋白基因进行分析，用ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ酶切发现了多态性。分析κ酪蛋白基因型与奶产量间的关系，第１胎ＢＢ基因型高于ＡＡ基因型，第２胎及总胎次ＡＡ基因型高于ＢＢ基因型。

胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞生长及κ-酪蛋白和胰岛素受体基因表达的影响

本试验旨在研究培养基中添加不同浓度的胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞生长及κ-酪蛋白(CSN3)和胰岛素受体(INSR)基因表达的影响。选用中国荷斯坦奶牛的乳腺上皮细胞进行体外培养,在以无血清无激素的生长培养基为对照的基础上,分别添加胰岛素5、50、500和5 000 ng/mL,测定CSN3和INSR基因表达量以及CSN3相对含量的变化。结果表明:1)胰岛素能够促进乳腺上皮细胞的增殖,其中5～500 ng/mL的胰岛素促增殖作用较好。2)胰岛素能提高乳腺上皮细胞CSN3、INSR基因表达量和CSN3相对含量,50 ng/mL组CSN3基因表达量和CSN3相对含量均显著或极显著高于对照组(P<0.01)以及5(P<0.01)、500(P<0.01)和5 000 ng/mL组(P<0.05),INSR基因表达量显著或极显著高于对照组(P<0.05)以及500(P<0.05)和5 000 ng/mL组(P<0.01)。结果提示,随着胰岛素浓度的增加,CSN3和INSR基因的表达量及CSN3相对含量均呈先增加后下降的趋势,50 ng/mL时最高,而高浓度(5 000 ng/mL)的胰岛素不利于奶牛乳腺上皮细胞合成乳蛋白。

西藏牦牛、荷斯坦牛三个功能基因部分序列多态性的比较研究

利用聚合酶链式反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术和聚合酶链式反应 限制性内切酶片段长度多态性(PCR RFLP)技术 ,测定了西藏牦牛和荷斯坦牛催乳素基因、β 乳球蛋白基因和κ 酪蛋白基因三个功能基因部分序列多态性。结果显示 :西藏牦牛和荷斯坦牛在催乳素基因和κ 酪蛋白基因位点上存在多态性 ,而在 β 乳球蛋白基因位点均未发现D等位基因。

亮氨酸水平对奶牛乳腺上皮细胞增殖及κ-酪蛋白合成相关基因表达的影响

本试验旨在研究添加不同水平亮氨酸对乳腺上皮细胞体外增殖及κ-酪蛋白(CSN3)合成相关基因表达的影响。选用中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养,以不含有亮氨酸的培养基为对照组(0×组),试验组培养基分别添加0.112 5(0.25×组)、0.225 0(0.5×组)、0.450 0(1×组)、0.900 0(2×组)、1.800 0(4×组)、3.600 0(8×组)、7.200 0(16×组)、14.400 0 mmol/L(32×组)的亮氨酸。试验采用噻唑蓝(MTT)比色法检测奶牛乳腺上皮细胞增殖;运用实时定量PCR检测CSN3合成相关基因相对表达量。结果表明:亮氨酸能够提高乳腺上皮细胞的相对增殖率。24和48 h时,除0.25×组外,其余各组与对照组相比细胞均差异均显著(P<0.05);72 h时,各组与对照组相比差异均显著(P<0.05);其中2×组的促增殖作用都达到最强。亮氨酸能够促进哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)、转录激活因子5(STAT5)和CSN3基因的表达,抑制真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)基因的表达,其中2×组对m TOR、S6K1、JAK2、STAT5和CSN3基因的上调表达最强,而对4EBP1基因的下调表达最强。总之,添加亮氨酸能够促进奶牛乳腺上皮细胞增殖和CSN3合成相关基因(除4EBP1)表达,亮氨酸水平为0.900 0 mmol/L时,其促进作用均达到最大。

天祝白牦牛α_(S1)-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。

酪蛋白三种组分的酶解特性研究

酪蛋白由3种成分组成,即αs-酪蛋白,β-酪蛋白,κ-酪蛋白。本文对酪蛋白的三种组分进行分离,用SDSPAGE电泳进行检测,得到相对纯度分别为89.50%、96.51%、90.99%。酪蛋白三种组分用胰蛋白酶进行酶解,对酶解物的水解度和粒度分布进行测定,酶解物的粒度分布用激光粒度分析仪测定。得到的结论是:在三种组分的酶解物中,αs-酪蛋白酶解物的水解度最高,随着酶解时间的延长,αs-酪蛋白酶解物中的粒径越来越小。β-酪蛋白酶解物在前12h水解度增加最少,β-酪蛋白酶解物在前6h粒度变化也不明显。κ-酪蛋白酶解物的水解度以线性形势增加,且κ-酪蛋白酶解10min内,粒径变化明显。

κ-酪蛋白基因及其功能研究进展

κ-酪蛋白(kappa-casein,-κCN)是牛乳中的一种重要的蛋白质。作者简要介绍了κ-酪蛋白基因的结构、遗传多态性与产奶性状的关系及其编码蛋白质的生物学功能等方面的研究进展。

大通牦牛三个功能基因部分序列的PCR-RFLP研究

采用PCR-RFLP技术,检测了大通牦牛α_(S1)-酪蛋白(α_(S1)-casein,α_(S1)-CN)基因、κ酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因和生长激素(growth hormone,GH)基因部分序列的遗传多态性。结果表明大通牦牛群体中α_(S1)-CN基因PCR-RFLP位点呈单态;κ-CN基因和GH基因2个PCR-RFLP位点均呈多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.1117和0.8883;GH基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.1755和0.8255。适合性卡方检验结果表明,大通牦牛GH基因和κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布均极显著偏离Hardy-Weinberg平衡定理(P<0.01);该3个位点平均基因一致度和基因多样度分别为0.8374和0.1626。

漏芦对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因表达的影响

为探讨漏芦对泌乳动物乳腺酪蛋白合成的调节机制,利用细胞活力分析仪检测漏芦乙醇提取物(25、50、100、200、400、600、800μg/mL)对奶山羊乳腺上皮细胞活力和增殖能力的影响,并选择不抑制细胞生长增殖的乙醇提取物剂量,研究其对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因mRNA表达的影响;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测乳腺上皮细胞αs1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白(CSN1S2)、β-酪蛋白(CSN2)、κ-酪蛋白(CSN3)、信号转导与转录激活因子5(STAT5)、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)、哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)、真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)及核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)基因的mRNA表达水平。结果表明,较高剂量(200~800μg/mL)的漏芦乙醇提取物明显抑制了奶山羊乳腺上皮细胞的活力和增殖能力(P<0.05),故后续试验添加25、50、100μg/mL的漏芦乙醇提取物处理乳腺上皮细胞;漏芦乙醇提取物可明显上调细胞酪蛋白基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3及酪蛋白合成相关基因STAT5、JAK2、mTOR、S6K1的mRNA表达水平(P<0.05),但显著下调了4EBP1基因的mRNA表达水平(P<0.05)。由此可见,漏芦乙醇提取物能通过调节奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因的表达,进而促进乳腺细胞酪蛋白的合成。

牦牛κ-酪蛋白新遗传变异体及进化分析

为明确牦牛乳中κ-酪蛋白中遗传多样性,以κ-酪蛋白基因(CSN3)的IV外显子为研究对象,采用PCR-RFLP方法对麦洼牦牛的CSN3进行分析,旨在从分子水平揭示κ-酪蛋白在牦牛乳中遗传多样性分布.并以CSN3的IV外显子序列建立牛属κ-酪蛋白的系统发育树,从而分析进化关系.结果表明,牦牛乳中κ-酪蛋白多数以纯合体形式存在,并发现了一个新的变异体GU441771.牛属CSN3的系统发育树分析表明,κ-酪蛋白在进化上存在一定的物种特异性.

与脐带间充质干细胞共培养促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成及其机制

目的研究脐带间充质干细胞(UCMSC)调节奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)乳蛋白合成的可能作用机制。方法利用TranswellTM小室将UCMSC和BMEC进行双层共培养,BMEC单纯培养为对照组,胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抑制剂AG1024处理细胞,ELISA检测上清IGF-1和β酪蛋白(CSN2)、κ酪蛋白(CSN3)含量变化,实时定量PCR检测Janus激酶2/信号转导子与转录激活子5(JAK2/STAT5)信号通路相关基因的相对表达丰度;再用JAK2信号通路阻断剂AG490孵育细胞,实时定量PCR检测CSN2、CSN3 mRNA的相对表达丰度。结果与UCMSC共培养后,BMEC的CSN2、CSN3合成量和CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、E74样ETS转录因子5(ELF5)mRNA相对表达丰度均显著高于单纯培养的BMEC;AG1024处理后,显著降低BMEC的CSN2、CSN3合成量,显著降低CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、ELF5 mRNA的相对表达丰度;给予AG490阻断后,显著降低CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度;在AG1024基础上,加入AG490后显著降低CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度。结论UCMSC能够通过IGF-1介导JAK2/STAT5信号通路,上调BMEC乳蛋白合成关键基因mRNA的表达丰度,促进其乳蛋白的合成。

辽宁绒山羊CSN3基因PCR-RFLP多态性分析

本试验以辽宁绒山羊和内蒙古绒山羊为实验动物,采用PCR-RFLP技术对-酪蛋白基因(CSN3)片段的Ⅰ的酶切多态性进行分析,结果表明:辽宁绒山羊和内蒙古绒山羊2个山羊群体中均存在CSN3基因Ⅰ酶切位点的多态性,且均有A、B两个等位基因。辽宁绒山羊群体等位基因A和B的基因频率分别为0.46和0.54;内蒙古绒山羊群体中等位基因A和B的基因频率分别为0.31和0.69。CSN3基因Ⅰ酶切位点的基因型分布在辽宁绒山羊群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡定理(<0.01),在内蒙古绒山羊群体中符合Hardy-Weinberg平衡定理(>0.05),但两个群体间存在显著差异(<0.01)。

牛κ酪蛋白基因变异及其与奶用性状的关系

文章综述了牛κ酪蛋白基因变异特征及其对生产性状的影响,并且对目前存在问题进行了讨论和展望。

κ-酪蛋白多态性对水牛乳酪蛋白体外消化性及消化产物生物活性的影响

为研究κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)多态性对水牛乳酪蛋白消化特性的影响,以水牛乳κ-CN多态性为依据,对不同κ-CN亚型的水牛乳酪蛋白进行体外模拟胃肠消化,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和邻苯二甲醛(OPA)水解度法分析其在消化过程中的情况,测定消化产物的抗氧化活性和血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。结果表明:水牛乳κ-CN存在AA、BB、AB、AC 4种亚型,不同κ-CN亚型的水牛乳酪蛋白的体外消化性存在差异,AB型酪蛋白消化水解最快,其次为BB型,AB型与AC型消化速度相近;不同κ-CN亚型的水牛乳酪蛋白消化产物具有一定的抗氧化性和ACE抑制活性。各κ-CN亚型的酪蛋白消化产物对ABTS自由基清除能力差别不大;BB、AA、AB型的亚铁螯合力相当,高于AC型;羟基自由基清除能力最高的是AC型;AA、AC型对ACE抑制活性高于AB、BB型。

傅里叶变换红外光谱的牛乳中α_(s)1-酪蛋白和κ-酪蛋白含量的快速检测

为了找到一种能够对牛乳中的两种主要过敏原(αs1和κ-酪蛋白)含量快速检测的方法,以河南、湖北、宁夏和内蒙古四省区的211份中国荷斯坦牛牛乳样本为研究对象,建立了基于傅里叶变换中红外光谱技术的牛乳中αs1和κ-酪蛋白含量的无损快速检测模型。首先对牛乳的原始光谱进行预分析,发现水对牛乳的光谱吸收具有很强的干扰,对水的两个主要吸收区域1597~1712和3024~3680 cm^(-1)进行分析,发现水的吸收区域1597~1712 cm^(-1)和蛋白的部分吸收区域1558~1705 cm^(-1)(酰胺Ⅰ)基本重合,通过对比去除1597~1712 cm^(-1)前后的效果,最终选择925.92~3005.382 cm^(-1)的光谱区域作为敏感波段用于后续分析。选取的全光谱经手动降维,利用MCCV剔除异常样本,分别采用标准正态变量变换(SNV)、多元散射校正(MSC)等8种预处理算法和竞争性自适应重加权算法(CARS)、无信息变量消除法(UVE)等3种特征选择算法联合建立支持向量机回归模型(SVR)。经检验,对于αs1-酪蛋白,一阶导数和CARS算法结合建立的SVR模型效果最优,训练集相关系数Rc和测试集相关系数R p分别为0.8827和0.8998,训练集均方根误差RMSEC和测试集均方根误差RMSEP分别为1.1363和1.3726;对于κ-酪蛋白,一阶差分和UVE算法结合建立的SVR模型效果最优,训练集相关系数R_(c)和测试集相关系数R_(p)分别为0.8808和0.8903,训练集均方根误差RMSEC和测试集均方根误差RMSEP分别为0.5345和0.5354。研究结果表明,基于傅里叶变换中红外光谱技术建立的SVR模型可以对牛乳中的过敏原α_(s)1和κ-酪蛋白含量进行无损检测,预测效果良好,此研究弥补了国内利用光谱技术对牛乳中的酪蛋白进行无损快速检测的空白。

GLGI技术鉴定奶山羊乳腺中的κ-酪蛋白基因

采用GLGI技术扩增本实验室构建的Long-SAGE标签库中的κ-酪蛋白基因。使用SMARTTM RACE cDNA Ampliication Kit通过RT-PCR把奶山羊乳腺组织中的mRNA逆转录成cDNA,分别用3’RACE和5’RACE扩增κ-酪蛋白基因的3’端和5’端。扩增产物经TA克隆后转化大肠杆菌,随机挑取阳性克隆后进行测序分析。通过序列比对、拼接,获得全长的κ-酪蛋白基因。应用GLGI技术成功获得了完整的奶山羊乳腺CSN3序列,为CSN3结构分析和功能研究奠定了重要基础。