基于λ核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测

基于G-四链体/血红素DNA酶的高催化活性以及λ核酸外切酶（λexo）的辅助放大功能,以17个碱基的DNA片段作为模型分析物,构建了一种快速、灵敏、特异性好的新型Luminol-H2O2-G-四链体/血红素DNA酶化学发光传感体系。考察了λexo用量、Luminol浓度、H2O2浓度、溶液p H值对体系化学发光强度的影响。在最佳实验条件下,即：p H=9.0,10 unitsλexo,1.0×10^-3mol/L Luminol,3.0×10^-2mol/L H2O2,测得DNA在2.0×10^-12~8.0×10^-9mol/L的浓度范围内与Luminol的相对化学发光强度之间呈现良好的线性关系,检出限（3σ）为0.7×10^-13mol/L。本方法可以区分不同错配的核酸序列,并可用于复杂生物样品的分析。

基于λ核酸外切酶辅助的级联型铜离子荧光检测体系的构建

通过将一种有效的级联信号放大策略引入铜离子荧光生物传感器中,构建了一种用于超灵敏检测铜离子的荧光检测体系。这种级联型荧光检测体系结合了λ核酸外切酶辅助的靶标回收和催化发夹自组装的循环信号扩增。在铜离子的存在下,用于识别铜离子的功能核酸的底物链被特异性切割和释放。释放出的单链DNA片段(tDNA)与5′端被磷酸标记的双链DNA(TQ-DNA)杂交形成具有平末端的双链DNA。随后,该DNA分子被λ核酸外切酶识别并切割,释放出游离的tDNA和TDNA。随着λ核酸外切酶的水解,越来越多的tDNA被回收,同时放出越来越多的TDNA。此时,TDNA作为催化发夹自组装反应的触发链,启动了新一轮的靶标循环。在TDNA的辅助下,作为分子信标的发夹DNA会与另外一个发夹DNA杂交形成新的双链DNA,同时,释放出高荧光强度。利用荧光光谱法对该体系不同反应阶段进行了表征。结果表明,该级联型铜离子荧光检测体系对痕量铜离子具有很好的响应。

基于PDANPs和T4 PNK、λexo生物传感技术建立

为找到一种快速灵敏检测miRNA-199的方法,分析纳米材料PDANPs表征,构建基于聚多巴胺纳米粒子(PDANPs)和T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)、λ核酸外切酶(λexo)的新型纳米生物传感技术检测miRNA-199平台,对影响生物传感技术主要因素进行优化,分析其线性范围和检测限;与茎环引物设计荧光定量PCR方法进行比对。结果显示:合成PDANPs直径300.0±31.7 nm,表面含有丰富的π电子;反应体系荧光强度与miRNA-199浓度的对数成线性关系,F=65.183 lg C+157.3、R 2=0.973;线性范围为10 pmol/mL^100 nmol/mL;检出限值为4.62 pmol/mL;与荧光定量PCR法比对结果偏倚为-0.22105 pmol/mL。结果表明,基于PDANPs和T4 PNK、λexo新型纳米生物传感技术可用于miRNA-199检测。

基于聚胸腺嘧啶单链DNA模板铜纳米簇的非标记碱性磷酸酶活性检测

以聚胸腺嘧啶单链DNA模板合成铜纳米簇(Cu^(2+)NCs)为探针,结合碱性磷酸酶(ALP)的去磷酸化性能和λ核酸外切酶(λexo)的特异性切割能力,构建了一种非标记、灵敏度高的ALP活性检测方法。研究了Cu^(2+)浓度、抗坏血酸钠浓度、ALP去磷酸化时间、λexo用量及反应时间等参数对荧光强度的影响,并对方法的灵敏度和特异性进行了评价。结果表明,优化的Cu^(2+)和抗坏血酸钠浓度分为0.75和2.50 mmol/L,ALP去磷酸化时间30 min,最优λexo用量和水解时间分别为23.3 U/m L和30 min。在优化条件下,ALP活性在0.05~0.5 U/L范围内与体系荧光强度呈较好的线性关系,线性方程为F=-2393.15c+1699.97,检出限为0.013 U/L。方法可用于血清中ALP的检测,加标回收率为96.7%~104.4%。