降解苯丙氨酸的工程益生菌构建及其喂养苯丙酮尿症小鼠的效果分析

苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种常染色体隐性遗传病,低蛋白饮食是目前临床治疗的主要方法,而采用工程益生菌治疗尚处于研发阶段。为了探究工程益生菌对PKU的治疗效果,该研究基于大肠埃希菌Nissle 1917(EcN)菌株,构建了一株表达苯丙氨酸裂解酶的工程益生菌EcN-PAL。通过λ-Red同源重组系统在EcN中导入经优化设计的苯丙氨酸裂解酶基因,并通过体外降解实验和小鼠喂养实验验证其功能性。实验结果表明,工程益生菌EcN-PAL成功表达苯丙氨酸裂解酶,并且可降解苯丙氨酸和有效降低PKU小鼠的血液苯丙氨酸浓度。该研究成功构建的工程益生菌EcN-PAL对苯丙氨酸有良好的降解效果,动物实验证实可有效治疗PKU小鼠,为用于PKU患者的益生菌治疗奠定了基础。

利用λ-Red重组系统和平衡致死系统改造抗药性致腹泻工程疫苗

质粒pMM085是含有猪毒素源性大肠杆菌(ETEC)的黏附素K88与无毒肠毒素LTA-B+基因的重组质粒,含氯霉素抗性基因,由此构建的菌苗株带有抗药性。利用平衡致死系统改建此疫苗株,即将质粒上的氯霉素抗性基因cat替换成asd基因,并把新构建的质粒转移到缺失asd基因的大肠杆菌X6097中。但由于质粒pMM085是一个23kD的大质粒,传统的基因工程操作不易进行,利用λ-Red重组系统,将表达Red重组蛋白的质粒pKD46转化含pMM085的大肠杆菌X6097,并用两端各带有39ntcat基因同源区、含全长asd基因的PCR产物电击转化此感受态细胞,在λ-Red重组系统的帮助下,成功实现了asd基因对cat基因的置换。

pBR322-Red介导的E.coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coliW 3110染色体lacZ,lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株:CWL2、CWL4和CWL6。荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达。为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1。证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中。结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达。

大肠埃希菌中λ-Red同源重组系统介导的trp和yfp基因融合表达的研究

目的为研究大肠埃希菌中色氨酸合成酶α亚基编码基因(trpA)的表达,利用λ-Red系统将trpA、黄色荧光蛋白基因(yfp)、氯霉素抗性编码基因(cat)融合片段敲入基因组中。方法将trpA、yfp、cat基因进行融合PCR,获得重组片段,转化入MG1655菌株中,利用pKD46编码的λ-Red系统将片段重组入基因组中,经PCR验证及测序鉴定正确后,荧光显微镜观察融合蛋白表达。结果成功获得trpA-yfp-cat重组片段,转化入MG1655菌株中获得阳性克隆,经测序鉴定正确。荧光显微镜观察可见细菌胞质内弥散分布黄色荧光,表明trpA-yfp融合表达片段成功地在MG1655菌株中表达。结论运用λ-Red系统可将trpA-yfp融合片段敲入MG1655菌株基因组中原位替换trpA基因,通过观察YFP蛋白的表达间接反映trpA基因的表达,具有不改变trpA基因自身功能和细菌生长的优点,为进一步研究大肠埃希菌色氨酸合成途径奠定基础。

CRISPR/Cas9和λ-Red基因敲除技术在大肠杆菌中的应用比较

λ-Red和CRISPR/Cas9基因敲除技术已被广泛应用于染色体基因敲除。本研究分别采用λ-Red和CRISPR/Cas9技术对大肠杆菌BL21菌株染色体丙氨酸消旋酶基因alr进行了敲除,并比较了其敲除效率。对于Red敲除技术而言,首先构建由alr上下游同源臂和卡那抗性盒FLT-kanR-FLT组成的打靶片段Lalr-FLT-kanR-FLT-Ralr,转化E. coli BL21/pKD46感受态细胞,在pKD46表达的Red重组酶作用下发生同源重组,使染色体alr被卡那抗性盒FLT-kanR-FLT替换;然后,质粒pCP20转化上述发生了alr替换的E. coli菌株感受态细胞,在pCP20表达的FLP重组酶作用下发生位点特异性重组,删除卡那抗性基因kanR;最后,对温敏型质粒进行消除,获得alr敲除突变株E. coli BL21 Δalr-Red。对于CRISPR/Cas9技术而言,首先构建敲除质粒pTargetF-alr,制备打靶供体DNA片段L-alr-R;接着,pTargetF-alr和L-alr-R共转化E. coli BL21/pCas感受态细胞,在pTargetF-alr编码的sgRNA序列引导下,质粒pCas编码的Cas9蛋白结合到alr基因切割靶点DNA,通过对双链断裂的同源重组修复实现对alr基因的无痕敲除,获得alr敲除突变株E. coli BL21 Δalr-CRISPR。实验结果显示:使用基于短、长同源臂靶打靶片段的Red技术,E. coli BL21 Δalr-Red阳性转化子检出率分别为5%和55%;而使用CRISPR/Cas技术,E. coli BL21 Δalr-CRISPR阳性转化子检出率为95%。实验结果表明:在E. coli中,使用短同源臂靶打靶片段的Red敲除技术,转化子脱靶率超高,这使阳性转化子鉴定工作量大增;使用长同源臂打靶片段的Red敲除技术,较为容易检测到阳性转化子;使用CRISPR/Cas9技术,敲除效率显著优于λ-Red技术。

利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。

沙门氏菌sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用

为探究sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpW表达的调控作用,研究利用λred同源重组系统构建ompW基因lacZ融合菌株,再通过P22噬菌体转导技术构建颜色指示菌株中rybB和hfq相关基因的单缺失株、双缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR分析,确定sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用。结果显示:成功构建了颜色指示菌株ΔompW∶∶LacZ和相对应的基因缺失菌株;与标准株LT2相比,ΔhfqY25A、ΔhfqK56A、Δhfq65、Δhfq87基因使ompW蛋白表达水平极显著下调(P<0.01),具有正调控作用,而Δhfq72、Δhfq∶∶tet、ΔrybB、ΔrybBΔhfq∶∶tet基因使ompW蛋白表达水平极显著上调(P<0.01),具有负调控作用;与标准株LT2相比,缺失hfq定点突变和rybB对ompW基因具有负调控作用。研究表明,沙门氏菌伴侣蛋白Hfq及RybB对孔蛋白ompW基因的蛋白表达水平和转录水平产生不同程度的影响,初步阐明了伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB和靶基因三者的内在关系,为沙门氏菌减毒活疫苗与新型抗菌药物研制的研究奠定基础。

atpA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响

为研究编码ATP合酶α亚基对大肠杆菌生物学特性的影响,本研究利用λ-Red同源重组技术构建貉源致病性大肠杆菌LCE-1(WT)atpA基因缺失菌株LCE-1ΔatpA(KO)和基因回补株LCE-1ΔatpA/pBR322-atpA(RS),并均采用PCR和测序鉴定。在此基础上,进一步分析atpA基因缺失对大肠杆菌的生长特性、生化特性的影响,结果显示,在LB培养基中KO菌株与WT菌株相比生长无明显差异,但在M9培养基中生长明显减缓;KO菌株的部分生化特性也发生了变化,对蔗糖、肌醇的分解利用发生改变,α-葡萄糖苷酶、β葡萄糖醛酸酶、精氨酸双水解酶活性也发生了改变。通过试管及微量结晶紫法分析3株菌生物被膜(BF)的形成能力,结果显示atp基因缺失能够显著降低大肠杆菌BF的形成能力(P<0.01)。对这3株菌进行酸应激、碱应激、热应激以及氧化应激测定这3种菌株对环境变化的应激能力,结果显示atp基因缺失能够显著提高大肠杆菌对酸应激、碱应激、热应激和氧化应激的敏感性。通过K-B纸片法对这3株菌的耐药性进行测定,结果显示KO菌株对多种抗生素的敏感性有所增强。利用KO、WT菌株分别感染小鼠进行致病性试验,结果显示,WT菌株的LD50为4.12×10^(7) cfu/mL,KO菌株的LD50为3.43×10^(8) cfu/mL,KO菌株毒力下降1个数量级。本研究构建了大肠杆菌的atpA基因缺失株,并证实AtpA蛋白在细菌的生化特性以及应对各种应激过程中具有重要作用,是大肠杆菌一个重要的多功能蛋白。

肠炎沙门菌greB基因缺失株构建及其生物学特性初步研究

目的研究旨在探究转录延长因子GreB对肠炎沙门菌致病力相关生物表型的影响。方法以肠炎沙门菌ATCC13076为亲本株,利用λ-Red重组系统构建ΔgreB基因缺失株及其回补株,测定肠炎沙门菌及其衍生菌在多种抑菌环境中生存能力、对细胞感染能力及在雏鸡体内繁殖动态,并采用RNA-seq检测和分析GreB对肠炎沙门菌致病力相关基因转录的影响。结果结果显示,greB基因缺失对肠炎沙门菌体外生长、生物被膜形成、SDS和高渗透压抵抗力无显著影响,但ΔgreB基因缺失株抗氧化能力显著提升;greB基因缺失减弱肠炎沙门菌对HCT116细胞入侵;与亲本株相比,ΔgreB基因缺失株在雏鸡肝脏、脾脏和肺脏的载量均下降,对雏鸡致病力下降约4倍;greB基因缺失导致肠炎沙门菌85个基因差异表达,其中34个基因表达下调,主要包括fim操纵子和inv操纵子,51个基因表达上调,主要包括pdu操纵子和ssa操纵子。结论greB基因缺失引致肠炎沙门菌多种毒力相关基因差异转录表达,增强肠炎沙门菌抗氧化能力,但降低其对上皮细胞侵袭力和动物致病力。

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。

1株asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌作为核酸疫苗载体的构建与鉴定(英文)

目的利用载体-宿主平衡致死系统,将1株香港分离的野生型沙门氏菌(S129)构建为减毒核酸疫苗载体。方法以细菌生化反应和血清学方法鉴定S129为鼠伤寒沙门氏菌;以λ-RED同源重组方法靶向敲除S129株的asdA基因,并以卡那霉素抗性基因代替;通过菌落PCR鉴定后挑取阳性克隆asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌(asdAΔS129),在含2,6-二氨基庚二酸(2,6-diaminopimelic acid,DAP)或无DAP的LB培养基中培养,与野生株S129对比生长曲线以验证asdAΔS129构建的成功;以S129和asdAΔS129攻击BALB/c小鼠验证asdAΔS129减毒情况;结果菌落PCR鉴定得到阳性克隆,asdAΔS129必需外源性添加DAP方能生长;asdAΔS129不能致死BALB/c小鼠,得到成功的减毒;结论成功将1株野生型沙门氏菌构建成asdA缺陷型减毒核酸疫苗载体,并在体外和体内实验中验证,为下一步的疫苗呈递和肿瘤治疗实验提供了合适的载体。

肠炎沙门氏菌rpoH基因缺陷株的构建及其热激响应特性

构建肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis IFO3313株的rpoH基因缺陷株IFO3313-ΔrpoH,比较不同温度下缺陷株与野生株的热激响应特性。利用λ-Red重组系统对Salmonella enteritidisIFO3313的rpoH基因进行缺失突变,并使用PCR方法对其进行验证,在此基础上使用不同培养基对缺陷株与野生株进行不同温度下的热激应答结果和亚致死热损伤修复能力的考察:野生株比缺陷株有更强的热激耐受能力,在DHL平板上对亚致死热损伤的肠炎沙门氏菌的分离检测可能具有假阴性,野生株比缺陷株在TSYA平板上有更强的修复能力。利用λ-Red重组系统敲除了肠炎沙门氏菌rpoH基因,有助于了解肠炎沙门氏菌的热激亚致死及其修复机制,对亚致死状态食源性病原微生物的检测做出初步研究。

大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略

基因敲除技术是大肠杆菌基因组减小和代谢途径改造的有效手段,其中基于同源重组原理的基因无痕敲除技术显现出其他技术所不具备的应用优势和发展潜力。该技术可以快速敲除大肠杆菌基因组中的目标基因,并且在基因组中不残留任何外源片段,所以不会干扰后续的基因操作。我们分类介绍了无痕敲除技术中所涉及载体的结构、功能及其相应的敲除策略,着重介绍了无痕敲除技术的原理及载体构建方法。

一种快速筛选海藻糖合成酶突变体体系的建立

利用λRed重组系统对大肠杆菌JM109的6-磷酸海藻糖合成酶基因OtsA和6-磷酸海藻糖酯酶基因otsB进行敲除,获得otsA和otsB基因失活的大肠杆菌突变体,该突变体由于对渗透压变得非常敏感,在含5%NaCl和0.5%麦芽糖的培养基中生长缓慢,然而当导入有活力的外源海藻糖合成酶基因后,由于能在胞内合成海藻糖,增强了细胞抗高渗透压培养基的能力,因而可让otsA和otsB基因缺失后的JM109得以恢复其生长能力。通过比较它们在高渗透压的培养基中的生长速度,可以筛选出含有不同活力的海藻糖合成酶突变体。

林麝肺源致病性大肠杆菌O78株crl毒力基因缺失株的构建及其生物学特性研究

大肠杆菌Crl和Rpo S蛋白的相互作用能够直接促进curli菌毛操纵子的表达,curli菌毛对宿主细胞的黏附性及侵袭性密切相关。为研究林麝肺源致病性大肠杆菌(LPEC)O78株crl毒力基因缺失对其生物学特性和毒力特性的影响,本研究采用λ-Red同源重组的方法构建了林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株LPEC O78-crl-,并通过生化特性、生长速率、红细胞凝集性、毒力特性对缺失株进行鉴定。结果表明,与野生株LPEC O78相比较,LPEC O78-crl-对林麝LPEC O78的生化特性和生长速率影响差异不显著;LPEC O78-crl-的红细胞凝集效价为2^(-4),比LPEC O78降低了2倍,其LD50为3.2×10~9 cfu/m L,与野生株LPEC O78相比下降约7倍。本研究构建了林麝LPEC O78-crl-,为进一步研究林麝LPEC的致病机理奠定基础。

用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株的构建

目的利用λ噬菌体Red重组酶系统,构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株。方法采用PCR方法,将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因拼接,使其两端带有与四环素基因同源的36nt序列;利用λ噬菌体Red重组酶系统,将其整合到大肠杆菌XL1-Blue的附加体上,以替换掉四环素基因,经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,获得包装菌株XLe-pⅢ;将基因Ⅲ缺失的噬菌体基因组导入包装菌株,制备缺陷型辅助噬菌体,集落形成试验检测缺陷噬菌体的感染能力。结果所构建的包装菌株XLe-pⅢ经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,证明氯霉素抗性基因已与噬菌体基因Ⅲ一同整合到附加体上,重组菌不能在含有氨苄西林的LB培养基中生长,仍保留四环素抗性;该包装菌株能用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体,制备的缺陷型辅助噬菌体的滴度为3.0×108。结论利用λ噬菌体Red重组酶系统,已成功构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株,以其制备的缺陷型辅助噬菌体有望用于常规筛选或SIP体系。

云南撒坝猪致病性大肠埃希菌外膜蛋白F(OmpF)缺失株的构建

为了进一步评价E.coli OmpF的功能,我们构建了E.coli外膜蛋白F的缺失突变株。首先根据E.coli F-M-2的测序后的OmpF基因序列设计PCR敲除引物,引物5’端分别有50bp和48bp的拟敲除基因的同源臂,3’端为扩增引物,以pKD3为模板,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因,然后利用pKD46的λ-Red重组系统替换E.coli F-M-2基因组上的OmpF基因,再利用表达FLP重组酶的质粒pCP20将FRT位点之间的氯霉素抗性基因删除,最后用鉴定引物进行鉴定并测序。结果成功地构建了云南撒坝猪致病性E.coli OmpF缺失突变株。

减毒鸡白痢沙门菌△aroA株的构建与致病性分析

以鸡白痢沙门氏菌c79-3强毒株为亲本,通过λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株△aroA,并进行了测序验证和毒力试验。结果表明,aroA基因缺失株的生长速度较亲本株缓慢,且该缺失株具有良好的遗传稳定性;相比野生菌株,aroA基因缺失株的毒力发生了下降,雏鸡攻毒死亡率较亲本株低。本研究获得的减毒鸡白痢沙门氏菌aroA基因缺失株△aroA,为进一步研究鸡白痢沙门氏菌aroA基因的功能和后续减毒活疫苗开发奠定了基础。

鼠伤寒沙门氏杆菌slrP基因缺失株的构建及其对细胞存活率的影响

为研究鼠伤寒沙门氏杆菌(ST)E3泛素连接酶SlrP对细胞存活率的影响,本研究利用λ-Red介导的同源重组技术,构建了STCVCC542株slrP基因缺失株(CVCC542ΔslrP),同时得到回补株CVCC542ΔslrP/pslrP。通过测定野生菌、缺失株和回补株的生长曲线及其对HeLa细胞存活率的影响,探究SlrP蛋白在ST感染过程中的作用。生长曲线显示,slrP基因的缺失和回补对CVCC542的生长无影响;细胞存活率试验结果显示缺失菌株与野生菌株相比细胞存活率明显升高(p<0.05),而回补株与缺失株相比细胞存活率明显下降(p<0.01)。本研究为进一步阐释ST引起细胞死亡机制和该病疫苗开发奠定基础。

鼠伤寒沙门氏菌STM LT2 Hfq关键作用位点的分析

为探究伴侣蛋白Hfq与GcvB及其靶基因oppA可能存在的关键作用位点,本研究通过λ-Red同源重组技术构建Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变菌株及Hfq C-端截短菌株,在此基础上构建相应的Hfq-His6标签蛋白标签融合菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的GcvB基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过Western blotting试验检测Hfq蛋白水平,实时荧光定量PCR检测GcvB和oppA基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA蛋白水平。Western blotting结果显示,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均不同程度地上调了Hfq蛋白水平。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,Hfq近端面核心氨基酸的突变使GcvB基因转录水平下调。β-半乳糖苷酶试验结果显示,与对照组相比,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均未造成oppA基因转录水平的明显变化,但均不同程度地上调了oppA蛋白水平,其中Hfq近端面核心氨基酸突变及Hfq C-端分别截短至第65和72位氨基酸时oppA蛋白水平上调最为明显,分别上调了2.9、3.3和2.0倍。以上结果表明,Hfq近端面对于Hfq维持GcvB稳定性非常重要,Hfq近端面第56位氨基酸及Hfq C-端第65-87位氨基酸与oppA蛋白水平呈负相关。