胞嘧啶单碱基编辑技术与λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株的比较研究

由食源性致病菌引发的食品安全问题是威胁人类健康的重要因素。因此,研究食源性致病菌的感染机理对于控制病原菌危害具有重要意义。【目的】以常见的食源性致病菌——鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,以其发挥重要致病性的转录调控因子SlyA为靶标,比较胞嘧啶单碱基编辑技术(CRISPR/Cas9-guided-Cytidine Base Editor,CBE)和λ-Red同源重组技术在构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株方面的方法差异,为鼠伤寒沙门氏菌的基因编辑技术应用提供数据。同时,也为其他类型病原菌的基因编辑技术开发提供有力参考。【方法】采用PCR、GoldenGate、Sanger测序等方法完成CBE系统以及λ-Red系统的构建以及敲除结果的验证,采用Editor-R软件分析CBE系统的单碱基编辑效率,采用Western blotting在蛋白表达层面对敲除结果进行验证。此外,本研究还结合了表型鉴定的方法验证了基因敲除结果。【结果】经PCR产物测序鉴定、Western blotting分析及溶血素活性鉴定等结果表明,本研究成功将CBE系统应用于鼠伤寒沙门氏菌slyA的单碱基编辑中,应用前述两种方法构建了鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株。【结论】CBE系统虽然以其操作的简便性在基因编辑中优势明显,但同λ-Red系统相比,该方法需要设立特定的gRNA及PAM位点,在非模式菌株中的普适性较低,且在进行编辑时,CBE系统存在不稳定的问题。尽管如此,但CBE系统在鼠伤寒沙门氏菌中的成功建立,为进一步拓展与完善该菌的基因编辑系统提供了基础。

利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。

降解苯丙氨酸的工程益生菌构建及其喂养苯丙酮尿症小鼠的效果分析

苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种常染色体隐性遗传病,低蛋白饮食是目前临床治疗的主要方法,而采用工程益生菌治疗尚处于研发阶段。为了探究工程益生菌对PKU的治疗效果,该研究基于大肠埃希菌Nissle 1917(EcN)菌株,构建了一株表达苯丙氨酸裂解酶的工程益生菌EcN-PAL。通过λ-Red同源重组系统在EcN中导入经优化设计的苯丙氨酸裂解酶基因,并通过体外降解实验和小鼠喂养实验验证其功能性。实验结果表明,工程益生菌EcN-PAL成功表达苯丙氨酸裂解酶,并且可降解苯丙氨酸和有效降低PKU小鼠的血液苯丙氨酸浓度。该研究成功构建的工程益生菌EcN-PAL对苯丙氨酸有良好的降解效果,动物实验证实可有效治疗PKU小鼠,为用于PKU患者的益生菌治疗奠定了基础。

1株asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌作为核酸疫苗载体的构建与鉴定(英文)

目的利用载体-宿主平衡致死系统,将1株香港分离的野生型沙门氏菌(S129)构建为减毒核酸疫苗载体。方法以细菌生化反应和血清学方法鉴定S129为鼠伤寒沙门氏菌;以λ-RED同源重组方法靶向敲除S129株的asdA基因,并以卡那霉素抗性基因代替;通过菌落PCR鉴定后挑取阳性克隆asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌(asdAΔS129),在含2,6-二氨基庚二酸(2,6-diaminopimelic acid,DAP)或无DAP的LB培养基中培养,与野生株S129对比生长曲线以验证asdAΔS129构建的成功;以S129和asdAΔS129攻击BALB/c小鼠验证asdAΔS129减毒情况;结果菌落PCR鉴定得到阳性克隆,asdAΔS129必需外源性添加DAP方能生长;asdAΔS129不能致死BALB/c小鼠,得到成功的减毒;结论成功将1株野生型沙门氏菌构建成asdA缺陷型减毒核酸疫苗载体,并在体外和体内实验中验证,为下一步的疫苗呈递和肿瘤治疗实验提供了合适的载体。

林麝肺源致病性大肠杆菌O78株crl毒力基因缺失株的构建及其生物学特性研究

大肠杆菌Crl和Rpo S蛋白的相互作用能够直接促进curli菌毛操纵子的表达,curli菌毛对宿主细胞的黏附性及侵袭性密切相关。为研究林麝肺源致病性大肠杆菌(LPEC)O78株crl毒力基因缺失对其生物学特性和毒力特性的影响,本研究采用λ-Red同源重组的方法构建了林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株LPEC O78-crl-,并通过生化特性、生长速率、红细胞凝集性、毒力特性对缺失株进行鉴定。结果表明,与野生株LPEC O78相比较,LPEC O78-crl-对林麝LPEC O78的生化特性和生长速率影响差异不显著;LPEC O78-crl-的红细胞凝集效价为2^(-4),比LPEC O78降低了2倍,其LD50为3.2×10~9 cfu/m L,与野生株LPEC O78相比下降约7倍。本研究构建了林麝LPEC O78-crl-,为进一步研究林麝LPEC的致病机理奠定基础。

减毒鸡白痢沙门菌△aroA株的构建与致病性分析

以鸡白痢沙门氏菌c79-3强毒株为亲本,通过λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株△aroA,并进行了测序验证和毒力试验。结果表明,aroA基因缺失株的生长速度较亲本株缓慢,且该缺失株具有良好的遗传稳定性;相比野生菌株,aroA基因缺失株的毒力发生了下降,雏鸡攻毒死亡率较亲本株低。本研究获得的减毒鸡白痢沙门氏菌aroA基因缺失株△aroA,为进一步研究鸡白痢沙门氏菌aroA基因的功能和后续减毒活疫苗开发奠定了基础。

鼠伤寒沙门氏菌STM LT2 Hfq关键作用位点的分析

为探究伴侣蛋白Hfq与GcvB及其靶基因oppA可能存在的关键作用位点,本研究通过λ-Red同源重组技术构建Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变菌株及Hfq C-端截短菌株,在此基础上构建相应的Hfq-His6标签蛋白标签融合菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的GcvB基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过Western blotting试验检测Hfq蛋白水平,实时荧光定量PCR检测GcvB和oppA基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA蛋白水平。Western blotting结果显示,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均不同程度地上调了Hfq蛋白水平。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,Hfq近端面核心氨基酸的突变使GcvB基因转录水平下调。β-半乳糖苷酶试验结果显示,与对照组相比,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均未造成oppA基因转录水平的明显变化,但均不同程度地上调了oppA蛋白水平,其中Hfq近端面核心氨基酸突变及Hfq C-端分别截短至第65和72位氨基酸时oppA蛋白水平上调最为明显,分别上调了2.9、3.3和2.0倍。以上结果表明,Hfq近端面对于Hfq维持GcvB稳定性非常重要,Hfq近端面第56位氨基酸及Hfq C-端第65-87位氨基酸与oppA蛋白水平呈负相关。

鼠伤寒沙门菌ompA基因缺失株的构建及生物学特性的分析

为探究外膜蛋白基因ompA对鼠伤寒沙门菌的生物学特性及对毒力的影响,本研究利用λ-Red同源重组技术构建ompA基因缺失株,通过比较检测生长曲线、运动性、生化特性、生物被膜形成能力、耐药性、细胞粘附性以及半数致死量(LD50)来检测野生株与基因缺失株之间的区别。结果显示,野生株与ompA缺失株的生长曲线、运动性、生化特性无明显区别;ompA缺失株的生物被膜形成能力极显著下降,对多种抗生素的敏感性增加,对细胞的粘附性和侵袭力均下降约79%;LD50的测定结果显示,STM LT2的LD50显著低于ompA缺失株,说明ompA的缺失显著降低了沙门菌对小鼠的致病力。综上所述,ompA的缺失能影响鼠伤寒沙门菌的部分生物学特性。以上结果为进一步研究外膜蛋白基因ompA基因的生物学功能及沙门菌致病性奠定了理论基础。

沙门菌伴侣蛋白Hfq及RybB对外膜蛋白相关基因fadL、ompN、ybfM的作用

为了解RybB sRNA、RNA伴侣蛋白Hfq对沙门菌外膜蛋白fadL、ybfM、ompN的作用,利用λ-red同源重组系统构建fadL、ybfM、ompN基因lac融合菌株,通过P22噬菌体转导完成颜色指示菌株中RybB、hfq基因的单缺失与双缺失,进行β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR,对其相应表达量进行分析.结果表明,Hfq抑制ybfM、ompN的表达,但fadL的表达上调;RybB sRNA抑制ompN、fadL的表达,但ybfM的表达上调.当Hfq与RybB共同对ybfM、fadL、ompN进行调控时,对ompN、ybfM的表达具有抑制作用,但fadL的表达上调,且Hfq的调控作用总体大于RybB.

沙门氏菌sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用

为探究sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpW表达的调控作用,研究利用λred同源重组系统构建ompW基因lacZ融合菌株,再通过P22噬菌体转导技术构建颜色指示菌株中rybB和hfq相关基因的单缺失株、双缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR分析,确定sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用。结果显示:成功构建了颜色指示菌株ΔompW∶∶LacZ和相对应的基因缺失菌株;与标准株LT2相比,ΔhfqY25A、ΔhfqK56A、Δhfq65、Δhfq87基因使ompW蛋白表达水平极显著下调(P<0.01),具有正调控作用,而Δhfq72、Δhfq∶∶tet、ΔrybB、ΔrybBΔhfq∶∶tet基因使ompW蛋白表达水平极显著上调(P<0.01),具有负调控作用;与标准株LT2相比,缺失hfq定点突变和rybB对ompW基因具有负调控作用。研究表明,沙门氏菌伴侣蛋白Hfq及RybB对孔蛋白ompW基因的蛋白表达水平和转录水平产生不同程度的影响,初步阐明了伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB和靶基因三者的内在关系,为沙门氏菌减毒活疫苗与新型抗菌药物研制的研究奠定基础。

atpA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响

为研究编码ATP合酶α亚基对大肠杆菌生物学特性的影响,本研究利用λ-Red同源重组技术构建貉源致病性大肠杆菌LCE-1(WT)atpA基因缺失菌株LCE-1ΔatpA(KO)和基因回补株LCE-1ΔatpA/pBR322-atpA(RS),并均采用PCR和测序鉴定。在此基础上,进一步分析atpA基因缺失对大肠杆菌的生长特性、生化特性的影响,结果显示,在LB培养基中KO菌株与WT菌株相比生长无明显差异,但在M9培养基中生长明显减缓;KO菌株的部分生化特性也发生了变化,对蔗糖、肌醇的分解利用发生改变,α-葡萄糖苷酶、β葡萄糖醛酸酶、精氨酸双水解酶活性也发生了改变。通过试管及微量结晶紫法分析3株菌生物被膜(BF)的形成能力,结果显示atp基因缺失能够显著降低大肠杆菌BF的形成能力(P<0.01)。对这3株菌进行酸应激、碱应激、热应激以及氧化应激测定这3种菌株对环境变化的应激能力,结果显示atp基因缺失能够显著提高大肠杆菌对酸应激、碱应激、热应激和氧化应激的敏感性。通过K-B纸片法对这3株菌的耐药性进行测定,结果显示KO菌株对多种抗生素的敏感性有所增强。利用KO、WT菌株分别感染小鼠进行致病性试验,结果显示,WT菌株的LD50为4.12×10^(7) cfu/mL,KO菌株的LD50为3.43×10^(8) cfu/mL,KO菌株毒力下降1个数量级。本研究构建了大肠杆菌的atpA基因缺失株,并证实AtpA蛋白在细菌的生化特性以及应对各种应激过程中具有重要作用,是大肠杆菌一个重要的多功能蛋白。

鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq与小RNA GcvB结合位点的初步分析

旨在探究Hfq与GcvB可能的作用结合位点,本研究首先筛查GcvB中Hfq结合偏好型富U基序。通过λ-Red同源重组酶系统构建GcvB富U基序突变或截短菌株,构建GcvB终止子茎延伸菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过qRT-PCR检测重组菌株的gcvB基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA基因编码蛋白水平。预测结果显示,GcvB存在2个Hfq结合偏好型富U基序U_(5)和U_(8)。qRT-PCR结果显示,U_(5)基序的突变未造成gcvB基因转录水平明显的变化,而gcvB基因转录水平随U_(8)基序的截短而下调,截短为U_(5)和U_(4)时下调最为明显,分别下调40.5%和37.5%。延伸U_(4)截短菌株的GcvB终止子茎,结果发现,gcvB基因转录水平几乎恢复到了对照组的水平,同时也发现,尽管U_(4)截短菌株gcvB基因转录水平得以恢复,却丧失了Hfq协同GcvB转录后负调控oppA mRNA的能力。以上结果表明,U_(5)基序与Hfq维持GcvB稳定性无明显关联。U_(8)基序对Hfq协助GcvB转录后负调控oppA mRNA以及维持GcvB稳定性是重要的,推测其为Hfq与GcvB的作用结合位点。

肠炎沙门菌C50041减毒疫苗候选株的构建与筛选

肠炎沙门菌是重要的食源性人兽共患病原菌,该菌主要感染禽类,并通过污染的禽制品感染人类,引起人的胃肠炎。为开发用于养禽业防控该病的疫苗,以肠炎沙门菌感染鸡模型中体内表达的抗原基因为靶标,研制减毒疫苗候选株。利用λ-Red同源重组系统构建肠炎沙门菌C50041体内表达抗原编码基因SEN0039、SEN1650、SEN2573及SEN2804的单缺失株,并对野生株和缺失株的生物学特性及对雏鸡致死率的差异进行比较分析。结果表明:4株基因缺失株的生长特性和生化特征未发生显著改变,且表现出良好的遗传稳定性。动物试验结果表明缺失株C50041ΔSEN0039对3日龄SPF雏鸡的LD50与野生株相比,升高近80倍,具有开发成鸡肠炎沙门菌减毒疫苗的潜力。这一研究为进一步研制禽副伤寒的减毒疫苗奠定了基础。

鼠伤寒沙门氏菌LT2 Hfq与fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR结合位点的预测与验证分析

通过5′RACE技术分析fadL、ompN、ybfM mRNA的5′UTR,并筛查fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR中Hfq结合偏好型基序(ARN)n.利用λ-Red同源重组酶和FLP重组酶系统构建fadL、ompN、ybfM基因(ARN)n基序缺失基础上的lacZ基因融合菌株,运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株,通过β-半乳糖苷酶试验检测重组菌株的蛋白水平.结果显示,fadL中筛选出ARN-1(AAAAAA)、ARN-2(AAAAATAAT),其缺失降低了fadL的蛋白表达量,分别降低72%、56%;ompN中筛选出ARN-1(GTTTTT)、ARN-2(TCTTTT)、ARN-4(TTTGCT),其缺失提高了ompN的蛋白表达量,分别提高了1.29、1.30、1.07倍,ARN-3(ATTATT)缺失使ompN的蛋白表达量降低了10%;ybfM中筛选出ARN-1(AAGAGG)、ARN-2(AGCAAT)、ARN-3(AGTAAA)、ARN-4(AAAAATAGT)、ARN-5(AACAGAAAG),其缺失均增加了ybfM蛋白水平变化,分别为4.20、3.99、10.90、227.00、46.00倍.结果表明,ybfM、ompN、fadL中(ARN)n位点不同缺失能导致ybfM、ompN、fadL表达水平出现上调或下调,部分(ARN)n序列缺失可影响Hfq对相应靶基因蛋白水平调控作用.

鼠伤寒沙门菌小RNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD的表达调控

【目的】探究小RNA(small RNA,sRNA)RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpD表达的调控作用。【方法】以鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium,STM)为研究对象,将含有编码β-半乳糖苷酶的lacZ报告基因的pCE40质粒转入ompD基因单缺失菌株中以获得lacZ报告菌株;在此基础上,利用P22噬菌体转导技术分在lacZ报告菌株中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短以获得双突变实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。通过β-半乳糖苷酶活性试验和RT-qPCR探究sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD表达的调控作用。【结果】成功在lacZ报告菌中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短等双缺失实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。与野生型(wild type,WT)菌株相比,在lacZ报告菌株中,hfq基因截短为87个氨基酸序列的突变株中的OmpD蛋白活性下调了2.16%,其余实验株OmpD蛋白的β-半乳糖苷酶活性均呈上升趋势。与WT菌株相比,实验菌株ompD基因转录水平除了STM LT2ΔompD::lacZΔhfq65的上调不具有显著性外,其余实验菌株均显著(P<0.05)上调,其中lacZ报告菌株、rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株ompD基因转录水平上调最明显,为1.83倍。【结论】ompD基因的转录及蛋白表达主要受hfq基因和sRNA RybB的负反馈调节;Hfq的远端面在对ompD基因的转录抑制中起关键作用。通过多个基因突变菌株的构建,阐述了sRNA伴侣蛋白Hfq与孔蛋白OmpD的相互作用关系,探索了Hfq对ompD的调控关键区域,丰富了sRNA的调控理论。

鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株的构建及生物学特性分析

利用λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株,并检测其生长特性、运动性、生物被膜形成能力、胞内存活能力及LD50毒力。结果显示,与野生型菌株相比,oppCDF基因缺失株的生长特性无明显变化;oppCDF基因缺失株可降低鼠伤寒沙门菌的运动性;oppC与oppF基因缺失后可提高鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力;同时,oppC基因缺失可降低在RAW267.4细胞内的存活能力和其在小鼠体内的毒力,oppF基因缺失可显著增强在RAW267.4内的存活能力和对小鼠毒力的影响,而oppD基因缺失后其在小鼠体内的毒力和RAW267.4内的存活率均无显著变化。研究表明,oppCDF基因与鼠伤寒沙门菌的运动性、生物被膜形成和毒力密切相关,为进一步揭示鼠伤寒沙门菌致病作用中的复杂调控和机制提供了理论基础。

鼠伤寒沙门菌孔蛋白ompW、ompS、ompD基因突变株的构建及生物学特性分析

为探究孔蛋白基因ompW、ompS、ompD对鼠伤寒沙门菌的生物学特性及毒力的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建相应突变株,通过检测生长曲线、泳动性、生化特性、体外遗传稳定性、生物被膜形成能力、耐药性、以及半数致死量(LD_(50))来比较鼠伤寒沙门菌标准菌株与各突变株之间的区别。结果显示,相比标准株,ompD和ompW基因突变株对细菌生长速率和运动能力影响较小,而ompS基因突变株的生长速率和运动能力则明显降低;3个突变株均不影响鼠伤寒沙门菌的生化特性,也不影响遗传稳定性,但能不同程度影响其对多种常用抗生素的敏感性,且均导致成膜能力极显著下降(P<0.01);LD_(50)毒力测定中,3个突变株毒力均导致鼠伤寒沙门菌的毒力下降,其中ompS基因突变株毒力下降最明显,LD_(50)为标准菌株的25倍。综上所述,孔蛋白ompW、ompS、ompD基因突变能影响鼠伤寒沙门菌的部分生物学特性。本研究结果为进一步研究孔蛋白ompW、ompS、ompD基因的生物学功能及沙门菌致病性奠定了试验基础。

大肠杆菌cpxR和hns双基因缺失株的构建

为构建调节蛋白H-NS及双组分信号转导系统CpxAR的单、双基因缺失株,本研究以大肠杆菌ATCC25922为研究对象,以pKD4质粒为模板,分别扩增出含kan^r基因的线性打靶片段,在pKD46质粒的辅助及L-阿拉伯糖的诱导下进行Red同源重组,使线性打靶片段替换大肠杆菌ATCC25922中的cpxR、hns基因,再用pCP20质粒消除FRT位点间的kan^r基因,构建单基因缺失株△cpxR和△hns。接着以△cpxR为研究对象,用同样方法敲除hns基因,构建双基因缺失株△cpxR△hns。最后将重组表达质粒cpxR-pBAD/HisA、hns-pBAD/HisA电转入上述3种缺失株中,制备回补菌株△cpxR/pcpxR、△hns/phns、△cpxR△hns/pcpxR和△cpxR△hns/phns。结果表明,利用该重组系统成功敲除了大肠杆菌ATCC25922中cpxR、hns基因,构建了单、双基因缺失株△cpxR、△hns和△cpxR△hns以及它们的回补菌株,为研究H-NS及CpxAR互作调控IncFⅡ质粒接合作用的分子机制提供了有力的工具。

鼠伤寒沙门菌T3SS相关基因缺失株的生物学特性分析

为探究沙门菌Ⅲ型分泌系统(STM T3SS)相关基因缺失株的部分生物学特性及致病力,本试验利用λ-Red同源重组技术构建T3SS相关基因缺失株LT2ΔprgI::scar、LT2ΔprgJ::scar、LT2ΔprgH::scar、LT2ΔprgK::scar、LT2ΔinvG::scar、LT2ΔinvC::scar和LT2ΔspaP::scar,以鼠伤寒沙门菌野生型(STM LT2)作为对照,通过生长曲线测定、遗传稳定性试验、生物被膜形成能力检测、细菌定植试验、细菌泳动性测定和动物致病性试验分析两者间的区别,结果显示:T3SS相关基因缺失株生长性变化不大,能够稳定遗传,但其定植能力、运动能力有不同程度的减弱;对于缺失株LT2ΔinvC::scar、LT2ΔprgH::scar、LT2ΔprgJ::scar和LT2ΔprgK::scar的成膜能力虽有小幅降低,但仍有较强的成膜能力,其余菌株在缺失后,成膜能力显著降低;LD50测定结果显示,相对于STM LT2,缺失株半数致死量LD_(50)数值均出现上升趋势,分别上升了2.57、4.07、406.76、161.89、89.75、89.75和64.45倍,证明缺失株毒力发生明显下降。以上结果为研究T3SS相关基因的生物学功能及沙门菌的致病性提供了理论基础,为鼠伤寒减毒疫苗研制与新型抗菌药物研发提供了新的思路。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 Ⅲ型分泌系统效应蛋白NleF基因敲除菌株的构建及其生物学功能初探

目的构建肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7 T3SS效应蛋白Nle F敲除菌株和回复菌株,研究其对细菌生长和细胞死亡的影响。方法利用λ-Red同源重组的方法构建nle F基因敲除菌株Δnle F;将p ET-24a(+)-Nle F重组质粒导入敲除菌感受态细胞中构建回复菌株Δnle F/Nle F。将野生株、敲除株和回复株分别用LB和DMEM(10%FBS)培养,每隔1 h测定D600,绘制生长曲线;分别用3种菌株感染He La细胞,用细胞毒性试剂盒检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量,计算细胞毒性。结果成功构建Nle F敲除菌株Δnle F和回复菌株Δnle F/Nle F;野生株、敲除株和回复株三者的生长速率无明显差异;与野生株相比,Δnle F感染He La细胞后,细胞毒性增加,Δnle F/Nle F感染后He La细胞毒性与野生株相当。结论 EHEC O157∶H7 T3SS效应蛋白Nle F对细菌的生长无明显影响,但可能抑制由细菌感染引起的宿主细胞死亡。