禽呼肠孤病毒σA蛋白在HEK293T细胞中的表达

为了正确表达禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白,试验拟构建σA基因的真核表达质粒,并将其在人胚肾细胞(HEK293T)中准确表达,参照GenBank中ARVS2基因序列(登录号为KF741763.1)设计特异性引物,以pMD18-T-σA重组载体为模板,应用PCR的方法扩增σA基因的特异性序列,并将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组pMD18-T-σA表达质粒,再用限制性内切酶KpnⅠ和NotⅠ同时双酶切pMD18-T-σA和真核表达质粒pEF1α-HA,将胶回收的σA基因和pEF1α-HA进行连接,构建真核表达质粒pEF1α-HA-σA。真核表达质粒经菌落PCR、双酶切和测序验证正确后,将其转染HEK293T细胞,于24h后收取蛋白质,通过WesteRn-blot验证目的蛋白。结果表明:本试验成功克隆了ARVσA基因,构建了其真核表达质粒pEF1α-HA-σA,并在HEK293T细胞中表达。说明该蛋白可以在HEK293T细胞中准确表达。

鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

【目的】构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。【方法】采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析。【结果】构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×10^6CFU,文库滴度为3.1×10^8 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000bp,重组率为91.67%。以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9)。【结论】通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARV σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据。

禽呼肠孤病毒σA基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。

禽呼肠孤病毒σA和σNS蛋白激活PI3K/Akt信号通路的研究

旨在探讨禽呼肠孤病毒(ARV)的σA和σNS蛋白是否是通过PXXP或YXXXM基序来激活PI3K/Akt信号通路的。作者采用重叠延伸PCR的方法,将σA和σNS基因的PXXP或YXXXM基序进行突变后构建了重组质粒,并在Vero细胞中进行了表达。通过流式细胞术和Western blot,检测转染后Vero细胞磷酸化Akt(P-Akt)的表达量,并与野生型σA和σNS蛋白激活的P-Akt表达量进行比较。结果显示,σA和σNS基因均得到了表达,σA基因的110—114和114—117位的PXXP基序突变后,Vero细胞P-Akt的表达量明显下降。可见,ARV的σA蛋白,是通过PXXP基序来激活PI3K/Akt信号通路的。本研究从细胞信号转导角度揭示了ARV与宿主相互作用的机制,也为寻找抗ARV药物作用靶标提供了新的思路。

禽呼肠孤病毒σA蛋白单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立

旨在制备禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白单克隆抗体及建立一种夹心ELISA方法检测ARV病原。以原核表达ARVσA蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,筛选稳定的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体,建立基于单克隆抗体的σA-夹心ELISA检测方法,并进行敏感性、特异性、重复性和准确性检验。结果显示,成功构建了重组质粒pET-32a-σA,并在大肠杆菌中良好表达。通过杂交瘤细胞筛选,获得了2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6B3和8E11,2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能与天然ARV反应。选择其中1株6B3分泌的单克隆抗体作为捕获抗体,ARV阳性鸡多克隆抗体作为检测抗体,通过优化反应条件,建立了检测ARV的σA-夹心ELISA方法。特异性检测显示该法只检出ARV病原,没有检出其他常见鸡病病原;敏感性试验显示其能检出7.72×10^(2)EID50/mL的ARV;重复性试验显示批内和批间试验的变异系数(Cv)均小于5.0%,重复性好。用σA-夹心ELISA方法与PCR方法同时对30份样品进行检测,两者检测结果相符。结果表明成功建立基于ARVσA蛋白单克隆抗体的夹心ELISA方法用于ARV的鉴别检测,为准确快速检测ARV提供技术手段。

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组（S1-4）中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明：鸭呼肠孤病毒（DRV）与禽呼肠孤病毒（ARV）的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76．0％～77．1％和78．4％～79．6％，氨基酸同源性分别为89．5％～91．2％和91.6％～92．7％；而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60．3％～64．4%和2．7%～9．9％，氨基酸同源性分别为61．4％～62．0％和22．6％～26．7％；DRV和ARV抗原性存在差异。而DRVS12／S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90．0％、93．6％、87．9％～88．0％和93．1%，氨基酸同源性分别为97．1%、94．3%、95．7%～95．9%和93．7％。进化树分析表明，DRV与ARV形成不同的分支，DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。

番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法的建立

根据经典和新型水禽呼肠孤病毒σA基因的保守序列设计一对PCR引物,通过优化病毒RNA提取方法和PCR条件,建立了番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法。该方法可自1株经典型或4株新型水禽呼肠孤病毒特异性扩增出436 bp条带,其最低病毒检出量为3.6 TCID50,而对鸭甲肝病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、坦布苏病毒、番鸭细小病毒、产蛋下降综合征病毒和H9N2亚型禽流感病毒扩增均为阴性。对2011-2012采集的224份（番鸭74、鹅68、鸭82）疑似临床病料进行检测,结果 56份为阳性,番鸭、鸭和鹅阳性率分别为59.5%（44/74）,11.0%（9/82）和4.4%（3/68）,表明水禽呼肠孤病毒主要在番鸭中流行。

番鸭呼肠孤病毒σA蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为实现番鸭呼肠孤病毒（MDRV）σA蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备,采用RT-PCR扩增了MDRV-YB株σA基因的完整编码序列（CDS）,双酶切并连接至表达载体p ET-32a（＋）中,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导蛋白表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析;随后对重组σA蛋白进行Ni2＋柱亲和层析纯化,用Western-blot鉴定纯化后重组蛋白的活性;最后以纯化后的包涵体蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,并用ELISA法检测其效价,Western-blot鉴定其特异性。SDS-PAGE分析表明,成功表达出分子质量约为64.2 ku的融合蛋白,且主要以包涵体形式存在;其IPTG诱导最佳时间、浓度和温度分别为6 h、1.2 mmol/L和24~27℃;经Ni2＋柱纯化获得了高纯度重组σA蛋白;Western-blot结果显示,纯化前、后的重组蛋白均可以与MDRV阳性血清发生特异性识别,说明纯化后的重组σA蛋白依然保留良好的反应原性;ELISA测得多抗血清的效价大于1∶32 000,Western-blot鉴定进一步证实制备的多克隆抗体可与重组σA蛋白发生特异性反应,为MDRVσA蛋白生物学功能研究奠定了基础。

CMOS数字集成温度传感器的开发

为了准确监测65 nm工艺的高速CPU芯片的工作温度,以保证CPU工作时风扇的运转以及过热报警,本文介绍了0.6μm的CMOS工艺设计实现的一种集成I2C总线通讯的具有远程测温功能的智能温度传感芯片.详细介绍了串联晶体管结构和Δ-ΣA/D转换技术、非重叠的控制时钟和CMOS开关的消除电荷注入误差的设计,使温度精度达到0.2℃;输出数字信号与I2C总线通讯的接口设计简化了后续信号处理和接口电路设计.测试结果表明,检测的温度范围从-15℃到95℃,本地温度误差在1℃以内,远程温度误差在0.75℃以内.

分布式电磁探测宽频数据采集系统设计与实现

将地球物理勘探中广泛应用于地震数据采集的分布式采集技术引入电磁探测仪器,针对被测电磁场信号宽频带、大动态范围、强噪声干扰的特点,通过设计低噪声的模拟信号调理电路,采用24位Δ-Σ结构模数转换器(Analog-to-digital,ADC)和现场可编程门阵列(Fieldprogrammable gate array,FPGA)构建了高性能的数据采集系统。利用微控制器及其外围功能模块实现了数据采集系统的工作流程控制、数据存储和传输。主要技术指标测试和水槽模型及野外勘探对比试验结果表明:该系统性能先进,测量准确,能够满足分布式电磁探测数据采集的需求。

24位Δ-Σ模数转换器CS5360的原理及其应用

CS5 3 60是 Crystal公司生产的一种高性能 2 4位Δ-Σ A/ D转换芯片。这种芯片适用于信号较弱、大动态范围、大数据量采集系统。文章详细介绍了 CS5 3 60芯片的结构、原理及特点 。

广义断裂性能曲面

分别利用多参数的福尔曼（Ｆｏｒｍａｎ）和沃克尔（Ｗａｌｋｅｒ）裂纹扩展模型，将应力强度 因子变程ΔＫ和应力强度因子均值Ｋｍ作为二元变量，建立了空间Ｋｍ－ｄａ／ｄＮ－ΔＫ曲面。考虑应力幅值和均值的共同作用，建立了沃 克尔型裂纹扩展 寿命 的σａ－σｍ－Ｎ＊曲面。作为表征材料断裂可靠性性能的重要指标， 讨论了断裂性能曲面的测定与拟合方法，并给出了具体应用实例。

禽呼肠孤病毒σA基因对鸡胚成纤维细胞天然免疫相关基因转录水平的调控影响

为了明确禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σA基因对宿主天然免疫应答的影响,本研究利用实时荧光定量PCR方法检测pCAGEN-σA转染鸡胚成纤维细胞(DF1)后,不同时间点(转染后第3、6、12、24和36小时)DF1细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、MAVS、My D88、TRIF、IRF-3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL等基因的转录水平变化。结果,与空载体转染细胞相比,pCAGEN-σA转染细胞中上述这些天然免疫基因的m RNA水平出现不同程度变化(P<0.05或P<0.01)。TLR3应对最快速,其m RNA水平在转染后第3小时和第6小时迅速上升,但9 h后逐渐下降;MDA5和TLR7的m RNA水平,则分别在转染后第6小时和第12小时开始显著升高,并分别在转染后第12小时和第36小时达到峰值(P<0.05或P<0.01);TLR15的m RNA水平整体变化不明显。My D88和MAVS的m RNA水平呈表达上调趋势;TRIF在转染后第6小时表达量迅速达到峰值(2.83倍),随后急速下降。NF-κB呈表达上调趋势;而IRF3/7的表达则被抑制。I型干扰素(IFN-α和IFN-β)呈现相似的表达模式,在转染后第6小时和第24小时表达量增加,其他时间点均为表达量下降; IL-6和IL-8则表达上调,分别在转染后第9小时和第6小时达到峰值(P<0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的m RNA水平也显著升高,均在转染后第12小时达到峰值(P<0.01)。上述试验结果表明,在DF-1细胞中过表达σA基因,能显著引起天然免疫相关基因的表达的变化,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机理奠定了基础。

声呐发射机驱动信号调制性能的研究

PWM(pulse width modulation)调制和ΣΔ调制方式均能将任意波形信号转化为一位比特流信号,可以作为声呐发射机的驱动信号。为对比研究这2种调制方式在声呐发射机驱动信号调制应用方面的性能,文中将理论分析通过仿真结果,从5种衡量声呐发射机驱动信号调制性能的指标着手做出评价。通过对比得出结论,在声呐发射机应用方面,两者具有相同的电效率,但ΣΔ调制具有更高的输出线性度和更小的谐波失真度。