新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种高效、便捷的新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)抗体检测方法,以大肠杆菌表达系统表达的重组σB蛋白作为包被抗原,建立了NDRV抗体的间接ELISA检测方法。对该检测方法的反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。结果显示建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:0.5μg/mL抗原4℃包被过夜,待检血清1∶400稀释37℃孵育60 min,显色时间为15 min,Cut off值为0.432。该方法对新城疫病毒(NDV)、鸭圆环病毒(DuCV)、新型鹅细小病毒(NGPV)和鸭坦布苏病毒(DTMUV)阳性血清均不存在交叉反应,且检测阳性血清的敏感度为1∶6400,批间和批内重复试验的变异系数均小于8%,该检测方法与市售NDRV抗体ELISA检测试剂盒的总符合率为96.88%。本研究成功建立了间接ELISA检测方法,为NDRV抗体检测提供了有效便捷的方法。

新型鸭呼肠孤病毒σB和σC蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)NP03株重组σB和σC蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测NDRV抗体的间接ELISA方法。优化后的最佳条件为:σB蛋白包被浓度为12.5μg·mL^(-1);σC蛋白包被浓度为6.25μg·mL^(-1);封闭液为15%FBS;血清稀释度为1∶80;酶标二抗稀释度为1∶400;底物37℃显色5min。该方法对MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。该方法与NDRV全病毒间接ELISA相比较,符合率高达92.5%。本研究进一步丰富了NDRV抗体的检测方法。

番鸭呼肠孤病毒σB和σNS基因克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,DRV)σB和σNS基因序列设计合成引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB和σNS基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物分别为1154bp和1113 bp,与预期的目的片段大小一致。核苷酸序列经BLAST软件分析表明：番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB基因与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为88．1%；氨基酸同源性为94．0%：σNS基因与法国89026株和89330株同源性分别为93．8%和93．1%；氨基酸同源性为95．9%和95．1%。而σB和σNS基因与禽呼肠孤病毒的同源性约为60%～80%。表明番鸭呼肠孤病毒是不同于禽呼肠孤病毒的独立基因群。

新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为制备新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a(+)-σB,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白。SDS-PAGE显示成功表达出约55ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度分别为3h和0.25mmol/L。经Ni 2+柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,将蛋白经Western blotting和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白,将纯化后σB重组蛋白按合理免疫程序免疫家兔,获得多抗隆抗体经Western blotting分析显示出特异性的反应。本试验结果为NDRVσB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础。

原核表达番鸭呼肠孤病毒σC与σB蛋白对雏番鸭的免疫保护

【目的】探讨原核表达的番鸭呼肠孤病毒(DRV)外壳蛋白σC与σB对于雏番鸭的免疫保护作用,为研制有效的DRV亚单位疫苗提供理论基础。【方法】对pET-30a-S3/BL21重组菌与pET-30a-S4 ORF2/BL21重组菌进行稳定性检验,表达的重组蛋白进行纯化和复性后,进行油乳剂制备,50只1日龄雏番鸭随机平均分为5组,即DRVσB蛋白免疫组、DRVσC蛋白免疫组、DRVσB+σC蛋白免疫组及PBS对照组和攻毒对照组,免疫组皮下接种剂量为500μg/只,7日龄时进行二次免疫,14日龄时进行攻毒试验,ELISA和琼扩(AGP)检测抗体水平并计算保护指数。【结果】重组菌具有良好的稳定性,各免疫组的雏番鸭均在第2次免疫后7 d产生了一定效价的抗体,其中DRVσB+σC蛋白免疫组和DRVσC蛋白免疫组的雏番鸭血清抗体ELISA效价均为1﹕200,高于DRVσB蛋白免疫组的1﹕100。攻毒保护试验结果表明,联合免疫的保护指数最高,可达70,重组DRVσC保护指数次之,为60,重组DRVσB蛋白保护指数最低,仅为40。【结论】使用原核表达的DRV外壳蛋白σC与σB制备油乳剂,联合免疫可诱导雏番鸭快速产生一定效价的抗体,并提供良好的免疫保护力。

新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

B蛋白是新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的外衣壳蛋白之一,可诱导宿主机体产生群特异性抗体。为制备NDRVσB蛋白的单克隆抗体(MAb),并鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达后纯化的重组σB蛋白(rσB)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,以纯化的rσB为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选出3株杂交瘤细胞,其分泌的MAb分别命名为10-A5、A1-A9和B7-E5。将NDRV ZJ00M株以MOI 0.01感染DF-1细胞72 h后收获细胞,通过western blot鉴定获得的MAb与天然表达的σB蛋白的反应性;分别将NDRV ZJ00M株、鸭经典呼肠孤病毒(CDRV)ZJ2000M株和鸡呼肠孤病毒(ARV)S1133株均以MOI 0.01感染DF-1细胞,48 h后经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定MAb的交叉反应性。Western blot结果显示,3株MAb均在41 ku出现特异性条带,表明其均能够与NDRVσB蛋白发生特异性反应;IFA结果显示:3株MAb均与NDRV反应,而不与CDRV和ARV发生交叉反应。上述结果表明,本研究制备的MAb反应原性和特异性均较强。利用人工合成的37条NDRVσB蛋白多肽及其截短的多肽,采用肽扫描法结合间接ELISA方法对3株MAb识别的抗原表位进行鉴定,并通过抗原表位氨基酸序列比对,分析该抗原表位在禽正呼肠孤病毒各成员中的保守性。结果显示,3株MAb识别的最小抗原表位均为33DIEEFHTPDVI43,且该抗原表位氨基酸序列在不同地域和不同宿主来源的NDRV分离株间的保守性均较高。本研究首次制备了NDRVσB蛋白的MAb,并鉴定了其抗原表位及该表位的保守性,为NDRV检测方法和表位标记疫苗的研究奠定基础。

广东新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因克隆及序列分析

为研究广东新型呼肠孤病毒(NDRV)的基因变异及遗传演化情况,本试验从广东不同鸭场病死鸭肝脏、脾脏等组织脏器中分离到8株流行毒株,用RT-PCR方法进行σB蛋白基因扩增、克隆与序列分析,并与其他毒株σB蛋白的氨基酸特性、蛋白抗原和蛋白基因进行系统进化比对分析。结果表明,广东省鸭群中感染的NDRV与国内其他地区报道的DRV核苷酸序列同源性很高,达96.6%~99.5%,而与禽呼肠孤病毒(ARV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的同源性则较低,分别为64.6%~66.5%和66.2%~67.1%;8株NDRV之间的核苷酸序列同源性高达97.7%~99.7%。与其他毒株比较结果显示,本试验分离的NDRV毒株磷酸化位点均比参考毒株ARV和MDRV少,且大多数区域的抗原指数都较高,抗原性与MDRV较为接近,遗传进化分析结果表明,NDRV和国内其他DRV处于独立的进化分支,ARV和MDRV则处于不同分支。结果表明,广东省流行的NDRV毒株σB蛋白基因序列高度保守,且广东地区分离的NDRV与国内其他地区分离的DRV没有明显的地域差异。

番鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的原核表达的番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σB蛋白为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,通过间接ELISA、Western-blot和免疫组织化学试验进行筛选及鉴定。结果显示,获得4株能够稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3F、B2B、C3E和D2G),其亚型分别属于IgG2bI、gG2bI、gM和IgM。采用小鼠体内诱生法制备的腹水均能与MDRV的σB蛋白发生特异性反应,表明,制备的单克隆抗体能够识别天然构象的σB蛋白。

一株新型鸭呼肠孤病毒的致病性及其σB基因进化情况分析

为了研究新型鸭呼肠孤病毒(novel Duck reovirus,NDRV)的致病性及其σB基因进化情况,试验采集河北地区病鸭的病变组织,经处理后接种SPF鸡胚进行病毒分离,鉴定该病毒的血凝特性,采用DNAStar等分子生物学软件对NDRVσB基因进行分析,以Reed-Muench法计算分离病毒的鸡胚半数致死量(ELD50),并研究该病毒对雏鸭的致病性。结果表明:用处理的第3代尿囊液接种9日龄鸡胚,鸡胚在48小时时开始死亡,死亡高峰集中在60小时,鸡胚主要病变表现为全身出血、水肿和肝脏坏死。分离毒株不能凝集SPF鸡红细胞。PCR扩增得到大小约为1162 bp的目的条带,分离病毒与GenBank中16株参考病毒核苷酸序列同源性为66.2%~99.5%,其中与NDRV Duck/N-DRV-XT18/China/2018参考株的核苷酸序列同源性最高为99.5%。分离病毒对鸡胚的半数致死量为1×10^(-5.67) ELD_(50)/0.2 mL,可致健康雏鸭死亡,剖检可见脾脏组织中散在分布大量坏死灶,坏死灶区域淋巴细胞变性、坏死,组织丧失固有结构;肝脏组织中肝细胞脂肪变性,局灶性肝细胞坏死。说明从河北地区病鸭组织中分离的病毒为NDRV,将其命名为CH-HB株,该病毒具有传播迅速、地域性等特征。

禽呼肠孤病毒99G株σB编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

采用RTPCR方法扩增禽呼肠孤病毒（ARV）99G株σB编码基因，序列分析表明，99G株σB编码基因与其他禽呼肠孤病毒的同源性为90％～99％，而与我国番鸭呼肠孤病毒S12株的同源性仅有60％；用BamHⅠ和XhoⅠ酶将σB编码基因切下并克隆到表达载体pGEX-6p-1中，构建了重组表达质粒pGEX-σB；鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，σB基因在大肠杆菌中得到了高效表达，表达的融合蛋白占总蛋白的41．46％，融合蛋白的分子质量为66ku，主要以包涵体形式存在；Western-blot结果显示，该融合蛋白能与抗ARV阳性血清发生特异性反应，表明重组蛋白具有良好的反应原性，可用于禽呼肠孤病毒病诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制。

北京鸭呼肠孤病毒σA、σB蛋白的二级结构及B细胞抗原表位的预测

应用SOPMA方法和DNAStar Protean软件综合分析了北京鸭呼肠孤病毒分离株DRV-GZ株的σA、σB蛋白的二级结构、亲水性、表面特性、柔韧性和抗原指数，并对各个蛋白的B细胞抗原表位进行了预测．结果表明，σA蛋白的32～37，56—61，82—85，107～116，128～141，202～207，239—246，256～260，274—280，312～317，381—391和σB蛋白的62～86，117～125，141～163，179～186，270—275，287～289，343～345区域内或附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域．

新型鸭呼肠孤病毒QY株σB蛋白基因特征、二级结构预测及其细胞抗原表位分析

本研究旨在对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)QY株σB蛋白的遗传变异规律和结构及功能进行分析。从GenBank数据库中获取QY株和25株参考株的σB蛋白编码序列,通过Mega 6.0软件进行序列比对分析和系统进化树构建;使用Datamonkey软件进行选择压力分析;运用生物信息学软件预测QY株σB蛋白二级结构功能及B细胞和T细胞抗原表位。相似性分析结果显示,NDRV QY株与国内其他地区分离的鸭呼肠孤病毒(DRV)氨基酸相似性达到94.9%~98.9%,与禽呼肠孤病毒(ARV)及番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的相似性仅为66.5%~68.4%和67.6%~68.4%;选择压力分析显示,σB蛋白承受净化选择压力,但存在一个正向选择位点;σB蛋白属于亲水蛋白,不具有信号肽和跨膜区,含有潜在的O-糖基化位点;结构预测分析显示,σB蛋白具有α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲等丰富的二级结构;表位分析显示,σB蛋白含有潜在的B细胞和T细胞抗原表位。本研究成功进行了QY株σB蛋白的基因特征和结构功能预测及其细胞表位分析,为深入了解该蛋白的免疫学特性及研发NDRV新型疫苗奠定了基础。

禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白二级结构及其细胞抗原表位预测

研究旨在运用DNAStar生物软件及Garnier-Robson、Chou-Fasman等方法分析禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)标准毒株S1133重要结构蛋白σB和σC的二级结构及其T细胞和B细胞抗原表位。通过分析其亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原指数等特性,对σB和σC蛋白的B细胞抗原表位进行预测;以Rothbard-Taylor和AMPHI方法预测σB和σC蛋白的T细胞抗原表位。结果显示,σB和σC蛋白形成α-螺旋结构的能力较差,但与σB蛋白相比,σC蛋白含有较多的β-折叠结构、转角及无规则卷曲等二级结构,因而σC蛋白二级结构较复杂。分析结果还表明σB和σC蛋白均含有潜在B细胞和T细胞抗原表位,尤其是σC蛋白具有较多的B细胞和T细胞抗原表位。本试验为深入研究σB和σC蛋白的免疫学特性及研发ARV新型疫苗和药物靶标奠定基础。

新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因密码子的优化及原核表达

试验旨在优化新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的原核表达系统,并评价sσB蛋白的免疫原性。根据已测得的NDRV-XX的σB蛋白基因序列,在不改变氨基酸序列的前提下,按照大肠杆菌密码子偏好性对σB蛋白全基因进行优化、合成并连接至pET-32a(+)质粒中,构建原核表达重组质粒pET-32a(+)-sσB,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达并优化表达条件。SDS-PAGE结果显示,最佳诱导表达时间、温度及IPTG浓度分别为3h、32℃和0.25mmol/L;可溶性分析结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。表达菌经超声破碎、变性、复性和Ni 2+柱亲和层析后,得到纯度高于90%的sσB可溶性蛋白,sσB重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株上的表达量较σB蛋白提升了14.6%,前者占细菌总蛋白量的32.3%。Western blotting结果显示,sσB重组蛋白具备NDRV抗原免疫反应原性。本试验成功构建并优化了NDRV-XX株σB蛋白的原核表达系统,提高了σB蛋白的表达量,并获得具有良好NDRV抗原免疫反应原性的σB重组蛋白,为后续NDRVσB蛋白功能及其应用的深入研究、基因工程疫苗的研发奠定了基础。

禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白在昆虫细胞中的共表达

本研究旨在获得具有天然构象和活性良好的禽呼肠孤病毒(ARV)σB和σC蛋白,采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达σB和σC蛋白,并对其活性进行鉴定。根据NCBI数据库中ARVσB和σC基因序列设计引物,将两个基因克隆至pFast-Dual载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭杆粒。通过转染sf9细胞,筛选到含有σB和σC基因的重组病毒。将重组病毒感染sf9细胞,通过优化接毒量和收获时间等参数,确定最佳表达条件,在sf9细胞中高效共表达σB和σC蛋白。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,成功在sf9细胞中共表达了ARVσB和σC蛋白,并具有很好的生物学活性。本试验结果为开发鉴别诊断试剂以及ARV颗粒疫苗的研究奠定了基础。

新型鸭呼肠孤病毒DH13株结构蛋白σB的原核表达及免疫原性分析

本研究旨在利用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)DH13株重组σB蛋白,并检测其免疫原性,为NDRV基因工程疫苗研制等提供物质材料。采用RT-PCR方法扩增获得NDRVσB基因,构建原核表达重组质粒pET-30a-σB和pET-32a-σB,将2个重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。纯化无His的σB蛋白,并以此蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体。利用Ni2+柱亲和层析法纯化含His的σB蛋白,以此蛋白作为检测原,通过间接ELISA方法测定兔源多克隆抗体效价;Western blotting鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性识别能力。结果显示,PCR扩增获得大小约为1100 bp的σB基因片段。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了2种重组σB蛋白,大小分别约为41和46 ku,均以包涵体形式存在。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶204800,能特异性地识别原核表达的重组蛋白,表明重组无His的σB蛋白具有良好的免疫原性。Western blotting特异性鉴定结果显示,含His的σB蛋白和无His的σB蛋白均与制备的兔源多克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达得到的重组σB蛋白具备良好的反应原性。本试验利用原核表达系统成功地表达出了重组σB蛋白,并证实了重组NDRVσB蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该结果将有助于后续对NDRVσB蛋白生物学功能的鉴定、NDRV诊断用抗原的制备及NDRV新型疫苗的研制。

不同加载速度对热轧带肋钢筋σ_s、σ_b测试值的影响

研究了不同加载速度对HRB335热轧带肋钢筋σs、σb测试值的影响。结果表明:在较高加载速度条件下,由于惯性抗力使材料的变形抗力提高,表现为材料的σs、σb测试值偏高。所以在作材料的拉伸性能测试时应严格遵循标准方法,保证测试结果准确。

退火低碳钢σ_s、σ_b与δ之间的关系

冷冲压生产工艺由于具有很大的经济效益,在机械制造工业中日益得到广泛的应用,在冷冲压生产工艺中,对冷冲钢材要求的机械性能是强度极限σb和延伸率δ10。有时亦对屈强比σs/σb提出一定的要求,用屈强比σs/σb来表示冷冲时塑性变形的能力。当σs/σb不大于0.65时,则冷冲钢材具有很好的冲压性能。我们知道,延伸率δ是用来描述金属材料塑性变形能力大小的一个塑性指标;而σs/σb也被用来表示冷冲时金属材料的塑性变形能力。同样是描述塑性变形能力的参数。那么,在冷冲钢中δ和σs/σb之间是否有某种联系。这个问题正是本文想要进行探讨的问题。一般地,低碳钢和低碳合金结构钢经正火或退火后得到了铁素体+珠光体组织。经拉伸后所得真实应力S和真实应变e的曲线形状如图1所示。

表达基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒σB和σC的重组4型禽腺病毒的拯救及鉴定

为获得1株能够融合表达基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒(avian reovirusⅠ-sub,ARV GCⅠ-sub)σB和σC的重组4型禽腺病毒(fowl adenovirus 4,FAdV-4)株,以禽腺病毒rHN20为病毒载体,构建表达σB和σC蛋白的重组黏粒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub,使用新型Fosmid黏粒拯救系统进行病毒拯救。通过PCR、间接免疫荧光试验(ⅠFA)、Western-blot以及体外复制动力学曲线鉴定重组毒株。结果显示,在感染的LMH细胞中成功检测到ARVGCⅠ-sub的σB和σC基因;Western-blot结果显示,在感染重组病毒的LMH细胞中成功检测到FAdV-4的Fiber蛋白、ARVGCⅠ-subσB和σC蛋白;ⅠFA结果显示,能特异性检测到FAdV-4的Fiber蛋白、ARVGCⅠ-subσB和σC蛋白;重组毒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub与亲本毒rHN20的复制能力无明显差异;表明重组病毒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub拯救成功。重组病毒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub的成功构建为同时靶向ARVσB和σC蛋白的ARV防控疫苗的研制提供了技术支撑,为ARV与FAdV-4的防控奠定了基础。

20#吊杆性能统计及σ_b与HB关系式建立

对我厂正火处理后的20#吊杆进行了3年的力学性能数据统计,采用回归方法求出了回归方程σb=181+2.24HB(MPa),可以通过HB值算σb,也可以从σb来估算HB,从而减少抽检数量。检查部门通过本文论述,结合生产情况可减少HB的检查数量。