高山被孢霉ω-3脂肪酸脱饱和酶基因在麦胚无细胞蛋白质合成系统中的表达

无细胞蛋白质合成系统具有快速、方便等特点,能表达对活细胞具有一定毒性的膜蛋白和抗菌肽,近年来被广泛应用。以来自产油丝状真菌高山被孢霉多不饱和脂肪酸合成途径中的关键膜结合酶——ω-3脂肪酸脱饱和酶为研究对象,构建了适宜体外表达ω-3脂肪酸脱饱和酶的表达载体p IVEX WG1.4-FADS15,并利用麦胚无细胞蛋白质合成系统实现了对该基因的高效表达。同时,通过在麦胚无细胞蛋白质合成过程中添加脂质体的方法,将所表达的膜蛋白正确定位至脂质体磷脂双分子层,以便目标蛋白质的正确折叠。研究结果显示,在此实验条件下目标蛋白质的表达量达1.8 mg/m L,经碘海醇密度梯度超速离心纯化后,该蛋白质的纯度可以达到90%以上。研究结果为后续对该酶进行催化特性研究和蛋白质晶体结构解析奠定了基础。

一种新ω-3脂肪酸脱饱和酶的克隆表达和活性鉴定

ω-3脂肪酸脱饱和酶催化ω-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)转化为ω-3 PUFAs,对ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)的合成至关重要。为了实现在常温下发酵生产ω-3 LC-PUFAs(主要是二十碳五烯酸,EPA),根据现有常温下偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脱饱和酶序列,从Gen Bank数据库筛选出与之高度相似的序列并进行生物信息学分析。为了确定序列的生物活性,进一步在酿酒酵母系统中进行重组表达,通过外源添加不同碳链长度的脂肪酸底物,测定重组酿酒酵母转化子在28℃和12℃下对不同脂肪酸的转化率。结果显示,新筛选序列编码的蛋白oAiFADS17既能催化18C PUFAs,又能催化20C PUFAs,尤其偏好催化二十碳四烯酸(AA)转化为EPA。oAiFADS17蛋白在28℃下对各种底物的转化率均高于12℃下的转化率,其中对AA的转化率达到46.3%。该研究成功测定了oAiFADS17蛋白对不同脂肪酸底物的转化率,得到了一种新的常温偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脱饱和酶,为构建高产EPA的基因工程菌株及EPA的工业化生产奠定了理论基础。

ω-3多不饱和脂肪酸健康机制及应用研究进展

ω-3多不饱和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids,ω-3 PUFAs)是一类重要的功能性高值脂肪酸,包括α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等,在膳食中主要来源于植物油或海洋多脂鱼类。近年来,利用微藻、丝状真菌、产油酵母等微生物生产ω-3 PUFAs,使其供应短缺、品质不稳定的问题显著改善,广泛扩大了其应用范围。ω-3 PUFAs在预防心血管疾病、神经退行性疾病、抑郁症、癌症,促进婴幼儿神经发育以及创面愈合和组织修复等方面均具有显著功效,其分子机制涉及缓解神经及系统性炎症、维持细胞结构及功能、激活机体免疫信号等。介绍了ω-3 PUFAs的结构及体内消化吸收过程,系统分析了DHA、EPA等发挥健康功效的分子机制及潜在的区别,总结了ω-3 PUFAs在食品中的应用形式,对ω-3 PUFAs应用的未来趋势进行了展望。提出了改进微生物发酵技术、构建高效基因编辑工具、开发活性保持技术等跨学科的研究方向,以期推动ω-3 PUFAs在食品和膳食补充剂领域的广泛应用。

1990~2019年中国和全球归因于Ω-3多不饱和脂肪酸摄入不足的缺血性心脏病疾病负担分析

目的分析1990~2019年中国和全球居民归因于Ω-3多不饱和脂肪酸(Ω3-PUFA)摄入不足的缺血性心脏病(IHD)疾病负担及变化情况。方法利用2019年全球疾病负担数据,选取年龄标化死亡率、标化伤残调整寿命年(DALY)率和平均年度百分比变化率(AAPC)等指标,对1990~2019年中国和全球居民归因疾病负担状况及变化趋势进行分析。结果2019年中国居民归因于Ω3-PUFA摄入不足的IHD标化死亡率为4.32/10万,标化DALY率为75.93/10万;而全球归因标化死亡率和DALY率分别为4.32/10万和90.65/10万。与1990年相比,2019年中国归因于Ω3-PUFA摄入不足的IHD标化死亡率升高12.88%,DALY率降低3.58%;而全球归因标化死亡率和DALYs率均较1990年下降,分别降低31.10%和28.74%。2019年中国归因标化死亡率和DALY率均表现为男性高于女性(5.77/10万vs.3.36/10万、102.10/10万vs.53.52/10万),且均随年龄增长而升高。1990~2019年,中国归因疾病负担整体呈先上升后下降趋势,归因标化死亡率AAPC为0.4%(95%CI:0.2%~0.6%,P<0.05),而DALY率AAPC为-0.1%(95%CI:-0.3%~0%,P<0.05)。结论在全球Ω3-PUFA摄入不足所致IHD疾病负担明显下降的背景下,中国在控制相关疾病负担方面仍有不足。适当补充Ω3-PUFA可能改善IHD疾病负担。

T2DM患者血游离脂肪酸、ω-3多不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸变化及与糖尿病肾病发生的相关性

目的探究2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)患者血游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)、ω-3多不饱和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acid,ω-3PUFA)、饱和脂肪酸水平变化及与糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)发生的相关性。方法随机选取2023-01/2023-12月作者医院收治的84例DKD患者纳入DKD组,选取同期60例单纯T2DM患者纳入T2DM组,另选取60例健康体检者纳入对照组。比较3组受试者FFA、ω-3PUFA及饱和脂肪酸水平,检测并比较3组受试者肾功能血尿酸(uric acid,UA)、血肌酐(creatinine,Cr)、肾小球滤过率(glomerular filtration rate,eGFR)和尿蛋白水平。采用Pearson法分析DKD患者血FFA、ω-3PUFA及饱和脂肪酸水平与肾功能UA、Cr、eGFR和尿蛋白水平的相关性。根据eGFR水平将DKD患者分为预后良好组(n=49)和预后不良组(n=35),比较两组患者血FFA、ω-3PUFA、饱和脂肪酸水平。结果与对照组比较,DKD组、T2DM组患者FFA、饱和脂肪酸、UA、Cr、尿蛋白水平明显升高,ω-3PUFA、eGFR水平明显降低(P均<0.05);与T2DM组比较,DKD组患者FFA、饱和脂肪酸、UA、Cr、尿蛋白水平明显升高,ω-3PUFA、eGFR水平明显降低(P均<0.05)。Pearson相关性分析显示,FFA、饱和脂肪酸水平与UA、Cr、尿蛋白水平呈正相关关系,与eGFR水平呈负相关关系(P<0.05);而ω-3PUFA水平与UA、Cr、尿蛋白水平呈负相关关系,与eGFR水平呈正相关关系(P<0.05)。预后不良组DKD患者FFA、饱和脂肪酸水平高于预后良好组,而ω-3PUFA水平低于预后良好组(P均<0.05)。结论T2DM患者血FFA、饱和脂肪酸水平升高,且二者水平与DKD发生正相关,ω-3PUFA水平降低,且其水平与DKD发生负相关,并且在一定程度上可反映DKD预后情况。

ω-3多不饱和脂肪酸在创面愈合中作用的研究进展

创面愈合是创伤后机体功能康复的前提,创面不及时处理会发生感染,若炎症反应过度,会影响愈合速度和质量。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acids,ω-3PUFAs)在创面愈合和组织修复过程中起着重要作用,可抑制炎症反应、促进血管生成、调节神经系统、控制血糖水平、抑制微生物生长、加速创面愈合。本综述介绍了ω-3 PUFAs的特性,探讨了ω-3 PUFAs促进烧伤、创伤性脑损伤创面、糖尿病烧伤、糖尿病足溃疡创面愈合的机制及其给药途径。

ω-3多不饱和脂肪酸在高血压中的作用机制及临床应用前景

高血压患病率逐年上升,为社会带来巨大的经济负担。研究发现,ω-3多不饱和脂肪酸可通过改善内皮细胞功能,增加一氧化氮生物利用度,激活血管平滑肌细胞的钾通道起到舒张血管、降低血压的作用。该文介绍ω-3多不饱和脂肪酸及其代谢产物降低血压的相关机制及临床应用前景。

ω-3多不饱和脂肪酸对家禽免疫机能的影响

随着我国家禽生产集约化养殖的普及,养殖密度加大,各种环境因素及病原体对家禽健康的影响越来越大,使家禽长期处于应激和免疫失调状态,进而影响其健康、生产性能和产品品质。如何改善家禽的健康状态,成为家禽营养研究的热点之一。研究发现,饲料中的多不饱和脂肪酸在动物营养中显现出重要的作用,直接影响动物的健康和免疫能力。文章综述了ω-3多不饱和脂肪酸对家禽生产性能和免疫功能的影响,以期通过营养性措施提高家禽免疫功能,为增强其抗病力提供参考。

ω-3多不饱和脂肪酸改善2型糖尿病研究进展

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是遗传与环境共同作用的结果,目前公认的2型糖尿病的病理生理变化主要涉及到胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损。许多研究显示,在T2DM发生发展过程中,炎症与氧化应激是调控胰岛素分泌的重要发病因素。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid, ω-3PUFAs)在调节炎症反应、糖脂代谢、氧化与抗氧化反应等方面具有重要作用。但能否有效改善T2DM的发病风险,目前尚存争议。本文结合近年来国内外的相关研究进展,综述了ω-3PUFAs在T2DM发病风险的具体作用机制。探讨饮食营养对改善T2DM的意义,为ω-3PUFAs改善T2DM以及相关营养干预提供依据。

内源性ω-3多不饱和脂肪酸对顺铂诱导的骨髓抑制的保护作用

目的:利用mfat-1转基因小鼠,探讨内源性ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)对顺铂诱导的骨髓抑制的保护作用及减少骨髓有核细胞凋亡的作用机制。方法:将实验动物分为4组,分别为野生型小鼠正常对照组、mfat-1转基因小鼠正常对照组、野生型小鼠模型组、mfat-1转基因小鼠模型组。模型组小鼠在d 0和d 7腹腔注射顺铂7.5 mg/kg构建骨髓抑制模型,正常对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水,每天观察小鼠状态并测量体重,14 d后取外周血进行血常规分析利用气相色谱检测外周血中PUFA的含量和比例;对各组小鼠股骨中骨髓有核细胞进行计数;通过组织病理学染色观察骨髓组织病理学变化;利用流式细胞术和荧光定量PCR技术检测各组小鼠骨髓组织中有核细胞凋亡情况和凋亡相关基因表达水平的变化。结果:与野生型小鼠相比,mfat-1转基因小鼠外周血中ω-3 PUFA含量显著增加且对顺铂具有更强的耐受性;外周血象分析结果显示,内源性ω-3 PUFA可促进骨髓抑制小鼠外周血中白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白的恢复;HE染色结果显示,内源性ω-3 PUFA显著改善顺铂诱导的骨髓组织结构损伤;流式细胞术和PCR结果显示,与野生型模型组小鼠相比,mfat-1转基因模型组小鼠骨髓有核细胞凋亡率显著降低(P<0.001),且抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达显著增加(P<0.01),而促凋亡基因Bax和Bak mRNA的表达显著降低(P<0.001,P<0.05)。结论:内源性ω-3 PUFA可通过调控凋亡相关基因的表达,减少顺铂引起的骨髓有核细胞凋亡,增加外周血细胞的数量,发挥对顺铂诱导的骨髓抑制的保护作用。

ω-3多不饱和脂肪酸衍生物消退素在骨保护中的作用

消退素作为一种特异性促炎症消退介质,对于炎症性疾病具有很好的治疗效果,在关节炎和牙周炎动物模型中都已得到了验证。然而,目前对于消退素在骨质疏松症和其他炎性骨病的影响研究较少,且缺乏系统的明确的作用机制阐明。本次综述通过查阅相关文献,分别从促炎消退、影响破骨细胞分化成熟和调控成骨细胞分泌相关因子的角度出发对消退素在炎性骨病中的作用进行阐述。由此可见,消退素的两种类型E类和D类均具有很好的骨保护作用,可以减轻炎症的发生,为治疗炎症引起的骨病或慢性炎症导致的骨质破坏提供了希望。

ω-3多不饱和脂肪酸对肝癌病人术后影响的研究现状

全球肝癌的发病率及死亡率较高,尽管早期发现并行根治性治疗的病人5年生存率可达60%以上,但术后应激、并发症以及肿瘤复发等严重影响术后病人的生活质量和生存周期。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acids,ω-3 PUFAs)由于具有调节脂质代谢、降低氧化应激、维持肠道健康等方面的作用,不仅被广泛作为商业食品补充剂用于预防肝癌的发生发展,还作为肠外营养脂肪乳剂的有效成分应用于术后病人。现有的研究表明,ω-3 PUFAs应用于肝癌术后病人可降低炎症反应、保护肝功能、减少感染等并发症的发生,从而缩短病人的住院时间。对于具有高危复发因素的病人,术后长期服用ω-3 PUFAs或联合其他辅助治疗也可能产生相应的有益效果,例如提高辅助治疗效果以及降低药物的不良反应等。但也有研究证实了与前研究结果相驳论之处。因此,ω-3 PUFAs的作用机制是复杂的,许多调控环节仍有待进一步研究,且其对肝癌病人术后临床相关指标的影响也需要大量的数据去证实。

以量化评估为指导的四级康复护理配合含ω-3多不饱和脂肪酸肠内营养支持治疗用于重症肺炎机械通气中的价值分析

目的探讨以量化评估为指导的四级康复护理配合含ω-3多不饱和脂肪酸的肠内营养支持治疗对重症肺炎机械通气患者营养状态、血气指标的影响。方法回顾性分析2022年6月至2023年11月天津医科大学总医院空港医院重症加强护理病房(ICU)收治的88例重症肺炎机械通气患者的临床资料,根据不同的营养干预方案分为A组(常规肠内营养支持治疗,44例)和B组(含ω-3多不饱和脂肪酸肠内营养支持治疗,44例)。同时给予两组患者以量化评估为指导的四级康复护理至出院前1 d。比较两组患者临床指标,干预前后运动功能情况、营养状态、血气分析指标。结果B组患者机械通气时间、ICU住院时间、总住院时间均短于A组;与干预前比,干预5 d后两组患者血红蛋白(HGB)、血清白蛋白(ALB)、血清前清蛋白(PAB)、动脉氧分压(PaO_(2))水平、运动功能独立性评定量表(FIM)评分均升高,且B组均高于A组;与干预前比,干预5 d后两组患者二氧化碳分压(PaCO_(2))均降低,且B组低于A组(均P<0.05)。结论以量化评估为指导的四级康复护理配合含ω-3多不饱和脂肪酸肠内营养支持治疗可促进重症肺炎机械通气患者康复,改善患者营养状态与血气分析状态,提高肌力与运动功能独立性。

微藻ω-3脂肪酸的合成、应用及展望

综述了微藻ω-3脂肪酸的生物合成途径、在食品工业中的应用及其生产工艺优化策略,展望了微藻产业的发展前景,以期为工业化生产富集微藻ω-3脂肪酸提供参考。

上海地区素食人群血清ω-3脂肪酸水平分析

目的:了解上海市素食人群血清ω-3脂肪酸的水平以及与杂食人群的差异。方法:于上海市区招募愿接受调查的成年健康素食者222名及同性别同年龄杂食者222名,通过超高效液相色谱串联质谱方法,测定血清ω-3脂肪酸的含量,包括α-亚麻酸(ALA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)。用非参数检验比较素食人群与杂食人群血清ω-3脂肪酸含量的差异。结果:虽然素食人群血清ω-3脂肪酸总量(μmol/L)与杂食人群无显著差异(21.26 vs 21.04,P=0.321),但素食人群血清ALA含量(μmol/L)显著高于杂食人群(15.05 vs 11.25,P=0.000),素食人群血清DHA、血清EPA (μmol/L)均显著低于杂食人群[(2.87 vs5.92,P=0.000)、(0.73 vs 0.98,P=0.000)]。素食人群中,全素人群血清DHA含量(μmol/L)显著低于奶蛋素人群(2.17 vs 3.10,P=0.000)。素食时长≥5年人群的血清DHA含量(μmol/L)显著低于素食时长<5年人群(2.59 vs 3.12,P=0.007)。结论:受调查的素食人群血清ω-3脂肪酸总量与杂食人群相当,虽然血清DHA和EPA含量较杂食人群低,但血清ALA含量较杂食人群高。

ω-3脂肪酸在儿童哮喘治疗研究中的进展

哮喘是一种广泛存在的呼吸系统疾病,在全球范围内具有相当大的影响力,其影响遍及不同地域,在不同人群中的发病率从1%到18%不等。从一系列观察性和干预性研究中收集到的数据表明了n-3脂肪酸在改善炎症方面的潜在治疗能力,这与哮喘发病机制密切相关。因此,ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFAs)已成为目前研究的一个焦点,是一种前景广阔治疗哮喘的辅助疗法,其治疗效果的机制是多方面的,特点是复杂的相互作用,包括两种直接方式,如将花生四烯酸置换为二十碳五烯酸的底物,并随后调节其代谢,以及还有涉及炎症基因转录激活调控变化的间接途径。此外,ω-3 PUFAs还能产生一系列专门的炎症相关介质,即消退素,它们在抑制炎症过程进展方面发挥着协同作用。重要的是,膳食中补充ω-3脂肪酸或其生物活性衍生物对健康的影响微乎其微。因此,通过补充ω-3脂肪酸这一非药物干预策略,有可能为哮喘的治疗带来益处。

ω-3多不饱和脂肪酸在医学中应用概况

ω-3多不饱和脂肪酸为生长、细胞代谢及肌肉运动供能,并作为结构物质和功能调节物,是近年心血管领域的研究热点,同时也是神经系统和细胞生长赖以维持的必须成分,尤其是大脑细胞和视网膜细胞的重要构成。该文从ω-3多不饱和脂肪酸对儿科学、心血管病学、代谢疾病和营养疾病学、外科学、消化系统疾病、神经精神病学、眼科学、口腔疾病、呼吸感染性疾病等各科疾病的防治,对近年关于ω-3多不饱和脂肪酸的临床应用研究进行了综述,以期能更好地服务于临床研究。

血清脂肪酸结合蛋白4及磷脂酰肌醇3-激酶与心力衰竭的相关性研究

目的 探讨血清脂肪酸结合蛋白4(FABP4)及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的水平变化与心力衰竭发生、发展的关系。方法 选取2023年10月至2024年4月安徽理工大学第一附属医院心内科住院心力衰竭患者89例,其中心功能Ⅲ级组41例,心功能Ⅳ级组48例,以及同时期入院检查排除心力衰竭患者89例作为对照组。采用ELISA法检测各组受试者血清FABP4、PI3K水平,分析两者在不同分组间的差异及临床意义,并应用Pearson相关性进一步检验FABP4、PI3K与N末端-B型钠尿肽前体(NT-proBNP)相关性。结果 与对照组相比,心功能Ⅲ级组及心功能Ⅳ级组患者的年龄、左心房前后径(LAD)、左心室舒张末期内径(LVDD)、左心室收缩末期内径(LVSD)、N末端-B型钠尿肽前体(NT-proBNP)、肌酐(Cr)、C反应蛋白(CRP)、空腹血糖(FPG)水平显著升高,而甘油三酯(TG)、左心室射血分数(LVEF)、左心缩短分数(FS)水平降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);心功能Ⅲ级组及心功能Ⅳ级组血清FABP4表达水平升高[(64.32±21.58)ng/ml比(75.20±26.37)ng/ml比(54.16±15.45)ng/ml,P<0.05]、血清PI3K表达水平下降[(889.07±155.23)U/L比(763.53±184.60)U/L比(980.37±201.86)U/L,P<0.05]。与心功能Ⅲ级相比,心功能Ⅳ级组血清FABP4表达水平升高[(75.20±26.37)ng/ml比(64.32±21.58)ng/ml,P<0.05]、血清PI3K表达水平下降[(763.53±184.60)U/L比(889.07±155.23)U/L,P<0.05]。Pearson法对FABP4、PI3K与NT-proBNP进行相关性分析,结果显示在所有实验组中FABP4水平与NT-proBNP大小呈正相关关系(r=0.711,P<0.05);PI3K与NT-proBNP呈负相关关系(r=-0.803,P<0.05),FABP4与PI3K水平呈负相关关系(r=-0.434,P<0.05)。结论HF患者血清中FABP4表达水平明显升高,并随着心功能分级增加而逐渐增加,PI3K表达水平明显降低,并随着心功能分级增加而逐渐降低,二者都与NT-proBNP有一定的相关性。可见,FABP4、PI3K的激活与表达与HF的发生可能有关。

血清脂肪酸结合蛋白4及磷脂酰肌醇33-激酶在心力衰竭中的作用研究进展

心力衰竭(HF)是各种原因导致的心排血量不足而引起的器官、组织血流灌注不足为临床表现的一组综合征,而心室重塑和心室舒张功能不全是HF发生发展的基本病理生理机制。脂肪酸结合蛋白4(FABP4)是一种细胞内脂质伴侣,参与脂肪和外周组织之间的串扰,在成熟脂肪细胞中被认为是最丰富的蛋白质之一。目前,FABP4已成为心血管疾病中研究的热点,近年来被证明会增加心脏代谢的危险。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是真核生物内一类催化肌醇与磷脂酰肌醇的重要激酶,近年来研究发现,PI3K/AKT信号通路的激活对心肌细胞的生长、代谢以及凋亡等活动产生影响,且该通路及其中的很多受体、激酶被证实与HF关系密切,本文主要从FABP4、PI3K的结构以及在HF中的作用机制进行阐述,为其临床诊断HF提供新的生物标志物及新靶点。

ω-3脂肪酸联合辅酶Q10对轻度高脂血症人群血脂干预效果的临床随机对照研究

目的:观察ω-3脂肪酸联合辅酶Q10对轻度高脂血症人群血脂、抗氧化及炎症水平的影响。方法:筛选解放军总医院第一医学中心门诊轻度高脂血症患者90例,采用随机、对照前瞻性研究方法,随机分为ω-3脂肪酸联合辅酶Q10组(A组)和对照组(B组),每组45例干预3个月,两组均常规给予低盐低脂饮食和运动指导,A组补充ω-3脂肪酸2粒3次/日和辅酶Q10胶囊2粒2次/日(早、晚)。于干预前、后比较两组间三大营养素摄入量、人体测量指标、体成分变化、血生化、抗氧化及炎症水平的影响。结果:共有82例患者完成研究,A组42例、B组40例。干预前两组间一般情况均无统计学差异(P>0.05);干预前后两组营养素摄入量、人体测量及体成分均无显著性差异(P>0.05);干预结束后两组间肝、肾功能、蛋白水平、胆红素、血脂水平等指标未见显著差异(P>0.05),但比较两组间干预前后差值变化水平(∆=结束-开始),发现A组∆TC、∆LDL-C及∆非-HDL-C下降水平显著高于B组(P<0.05);抗氧化水平的影响,发现A组∆MDA水平显著高于B组(P<0.05),炎症指标水平未见显著性差异(P>0.05)。结论:轻度高脂血症人群补充ω-3脂肪酸和辅酶Q10,对其肝肾功能无不利影响,能改善其血脂及抗氧化水平,起到降低动脉粥样硬化性心血管疾病风险的作用。