缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的特性及在氮饥饿过程中相对转录量的分析

根据莱茵衣藻和普通小球藻ω3脂肪酸去饱和酶氨基酸序列(GenBank登录号分别为ABL09485和BAB78717)的保守区(TMFWALF和HHDIGTH)设计简并引物,以缺刻缘绿藻H4301总RNA为模板,通过反转录PCR和cDNA末端快速克隆技术(RACE),克隆了缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的cDNA全长序列(GenBank登录号:EU658930),它与莱茵衣藻的这个基因具有69%相似性。该基因cDNA序列长2330bp,其中5'-非翻译区长107bp;3'-非翻译区912bp,且具有明显的poly(A)尾巴;开放阅读框1311bp,编码一个436个氨基酸的蛋白质,分子量为49.06ku,等电点7.85;该基因编码的蛋白为膜结合蛋白,含有2个疏水区域和3个保守的组氨酸簇基序。将该基因的cDNA序列与其DNA序列比对后,发现该基因在其编码区存在6个内含子,剪切位点均符合"GT-AG"规则。实时荧光定量PCR结果显示,在氮饥饿培养过程中,缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的相对转录量在4h时可能因休克显著提高(P<0.05),然后开始下调,12h开始显著下降(P<0.05),并在20h降到最低(约为完全培养基的11.6%),此后保持在低水平(为完全培养基的23.2%)波动(P<0.01)。脂肪酸组分的气相色谱结果表明,在氮饥饿培养过程中,花生四烯酸占总脂肪酸的百分含量逐步提高,而作为多不饱和脂肪酸ω3合成途径的产物,如α-亚麻酸和十六碳三烯酸(16∶3ω3)的百分含量在40h或96h后都显著降低(P<0.05)。这些结果表明缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因在氮饥饿过程中的相对低转录量,导致ω3合成途径相关产物百分含量的降低,确保了该藻沿着ω6途径来合成与积累花生四烯酸以提高其百分含量。另外,十六碳二烯酸(16∶2ω6)、亚油酸及花生四烯酸都可能是该克隆基因所编码ω3脂肪酸去饱和酶的反应底物。

来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。

过表达ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1保护小鼠胚胎成纤维细胞避免凋亡

由于膳食原因,人体摄入ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比例过高,脂类代谢严重失衡.鉴于ω-3PUFAs获取困难而且人体无催化ω-6PUFAs向ω-3PUFAs转化的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,本研究体外扩增来源于秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因(fat-l)cDNA,构建了真核表达载体pEGFPC1-fat-1,将该基因转染入小鼠胚胎成纤维细胞;激发荧光与RT-PCR方法检测转染pEGFPC1-fat-1细胞表达该基因,气相色谱分析显示该转染细胞中ω-6PUFAs/ω-3PUFAs的比例降低;细胞抑制率实验显示转染细胞的MTT吸光值升高(P<0.05);双染法流式细胞仪分析转染细胞凋亡降低,结果表明fat-1基因即使在高浓度ω-6PUFAs的细胞毒作用下,依然能够发挥将ω-6PUFAs脱氢转化为与ω-3PUFAs的生理功能,抑制3T3细胞凋亡,促进细胞生长增殖,实现了较强的细胞保护功能.

牛胎儿成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因

为利用核移植法获取转基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛胎儿成纤维细胞并进行了携带线虫ω-3脂肪酸去饱和酶cDNA的表达载体转染。首先采用组织块贴壁法分离培养牛胎儿成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染牛胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对阳性克隆进行传代2～3次后利用RT-PCR检测外源基因的转录。结果表明,组织块贴壁后7天可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9天即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示CMV启动子和ω-3脂肪酸去饱和酶cDNA整合到细胞基因组中,RT-PCR检测显示ω-3脂肪酸去饱和酶mRNA在转基因传代细胞中得到有效转录,为下一步通过核移植方法获得转基因肉牛提供了基础。

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体的构建与转化

内质网型ω-3脂肪酸去饱和酶(FAD3)是不饱和脂肪酸合成途径中催化十八碳二烯酸[18∶2(9,12)]转化为十八碳三烯酸[18∶3(9,12,15)]的关键酶。通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到LeFAD3的全长cDNA,基因全长为1 184bp,开放阅读框(ORF)为1 134bp,注册号为EU251190。将该基因正反向序列分别插入带有35S-CaMV启动子pBI121表达载体下游,获得正、反义表达载体,转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导法转化番茄,获得转基因番茄植株。

n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1在人肺癌细胞H460内的表达

n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1来自于秀丽线虫(C.elegans)。为检测该基因在人肺癌细胞H460中的表达效果,本项研究构建了哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)myc-HisA-fat-1,以Xfet polymer介导法转染到人肺癌细胞H460中,RT-PCR检测到有效的异源基因表达,MTT法证实基因表达能有效地抑制肺癌细胞的增殖率(P<0.05),气相色谱分析基因表达前后细胞中n-6/n-3多不饱和脂肪酸比例降低(P<0.05),为将该基因用于癌症的转基因治疗奠定了基础。

牛耳皮肤成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因研究

为了核移植法制作转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛耳成纤维细胞并进行了线虫-ω3脂肪酸去饱和酶基因。采用胰蛋白酶消化法分离培养牛耳皮肤成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染细胞,通过G418筛选9 d获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对阳性克隆进行传代2~3次后,利用RT-PCR检测外源基因的转录。结果表明：细胞贴壁后9 d可获取原代皮肤成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示CMV启动子和ω-3脂肪酸去饱和酶基因整合到细胞基因组中,RT-PCR检测显示ω-3脂肪酸去饱和酶基因在转基因传代细胞中得到有效转录。本研究为下一步通过核移植方法获得转基因肉牛提供了条件。

低温诱导球等鞭金藻3011脂肪酸去饱和酶基因片段的筛选及mRNA表达分析

本实验通过设计特异引物序列,对经低温诱导处理的球等鞭金藻3011的脂肪酸去饱和酶基因片段进行筛选,以实时荧光定量聚合酶链式反应检测酶的表达量,探索低温对该多不饱和脂肪酸脱饱和酶基因表达量的影响。结果表明:用prime5设计包括内参基因在内的14条引物,其中7条引物具有特异性扩增,根据扩增效果对其扩增体系进行优化。结果表明:Des4、Des5、Des6、Des8、Des9和Des12 m RNA相对最大表达量分别为7.71、11.33、42.58、22.02、73.91和16.01。随温度的降低均呈现先增加后降低的趋势。根据SPSS 19.0统计分析,6个基因在其m RNA相对表达量最大的诱导时间时,18℃的m RNA相对表达量与其在12、15、21℃3个温度条件下的相对表达量相比具有极显著差异(P<0.01)。18℃条件下诱导24 h可以有效增加Des9基因在球等鞭金藻3011中的表达。此研究结果为人为调控微藻的多不饱和脂肪酸含量提供了一条可行的方法。

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶(LeFAD3)基因的部分编码区,该片段cDNA为309 bp,将其克隆到pET-30a(+)载体中,酶切位点分别是BamHⅠ和SacⅠ,构建了原核表达载体pET-LeFAD3,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,经IPTG诱导蛋白表达,提取蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。酶切鉴定结果表明,LeFAD3基因原核表达载体构建成功,目的蛋白成功表达。

野生蕉ω-3脂肪酸去饱和酶基因FAD7密码子偏性分析

为了解FAD7的密码子使用特性,试验采用CodonW、SPSS19.0、MEGA5.0等软件和EMBOSS在线程序对野生蕉FAD7密码子偏性进行分析,同时与其他单/双子叶植物FAD7和模式生物基因组进行比较。结果显示,野生蕉FAD7密码子偏性水平较弱,密码子组成和结尾偏好使用G或C,而CUC、CAG和AGG等在该基因中具有较高的使用频率;物种间FAD7比较结果发现,单子叶植物FAD7密码子组成明显偏好G或C,而双子叶植物则完全相反;基于密码子使用频率FAD7聚类结果与CDS分类结果一致,均能将单/双子叶植物区分开来;此外,大肠杆菌原核表达受体系统可作为野生蕉FAD7基因异源表达理想试验体系。研究结果为野生蕉FAD7后续结构和功能研究提供了科学依据。

植物脂肪酸去饱和酶及其编码基因研究进展

脂肪酸去饱和酶是催化脂肪酸链特定位置形成双键和产生不饱和脂肪酸的酶类。植物脂肪酸去饱和酶主要有5种(FAD2、FAD3、FAD6、FAD7和FAD8),可分为ω-3型(FAD2、FAD6)和ω-6型(FAD3、FAD7、FAD8)两大类。其编码基因(FAD2、FAD3、FAD6、FAD7和FAD8)在植物中一般有多个拷贝。同种基因在不同植物中拷贝数不同,同一植物中相同基因的不同拷贝间在序列特征、表达调控和功能等方面也存在显著差异。本文根据国内外对脂肪酸去饱和酶基因及编码产物的研究现状,分别从它们的分类、拷贝数、结构、作用机制、表达调控等方面的研究进展进行了详细的分类阐述。

草鱼脂肪酸去饱和酶和延长酶基因cDNA全序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏中控制高不饱和脂肪酸(HU-FA)合成的脂肪酸去饱和酶(FAD)和脂肪酸延长酶(ELO)基因cDNA全序列.结果表明,草鱼FAD基因cDNA全长为1 994 bp,开放阅读框(ORF)为1 332 bp,编码444个氨基酸.编码的蛋白序列包含FAD全部特征结构区,包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素b5结构域,与其他鱼类的FAD氨基酸序列具有63.5%～70.5%的同源性.通过系统树分析,显示其在系统树中与草食性淡水鱼的亲缘关系最近.克隆得到的草鱼ELO的全长cDNA序列1 131 bp,含有876 bp的ORF,编码291个氨基酸.该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构,与其他类别ELO氨基酸具有70.6%～89.3%的同源性.系统树分析显示其在系统树中与草食性和杂食性淡水鱼类亲缘关系较近.草鱼FAD和ELO cDNA全序列的获得为今后进一步研究其体内高不饱和脂肪酸合成途径及阐明该途径在不同鱼类中的分子进化机理奠定基础.

脂肪酸去饱和酶基因的研究进展

多不饱和脂肪酸(PUFAs)对人体有重要的生理功能,脂肪酸去饱和酶是PUFAs合成途径中的关键酶,它控制着PUFAs的不饱和程度。近年来,随着对脂肪酸去饱和酶基因的研究,脂肪酸去饱和酶的研究得到了快速发展。从藻类、真菌、植物和动物等方面简述脂肪酸去饱和酶基因,特别是Δ9和Δ6脂肪酸去饱和酶基因方面的研究近况。

茶树△12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2和FAD6的克隆与表达分析

本研究在茶树转录组测序的基础上,以铁观音茶树的芽叶为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树不饱和脂肪酸合成途径中的关键限速酶—△12-FAD(12-脂肪酸去饱和酶)基因的包含完整ORF的cDNA序列(CsFAD2和CsFAD6)。生物信息学分析结果表明,CsFAD2的全长为1 184 bp,其开放阅读框(ORF)长度1 149 bp,编码382个氨基酸,定位于内质网上,其氨基酸序列与油茶FAD2的同源性最高达97%;CsFAD6的全长为1 425 bp,其ORF长度为1 311 bp,编码436个氨基酸,定位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄FAD6同源性达81%。荧光定量PCR结果表明,铁观音茶树幼苗在4℃低温胁迫处理72 h过程中,这两个基因的表达均受低温的诱导,其表达量随着处理时间的延长而升高,在处理48 h时,表达量水平最高;在100 g·L-1的PEG胁迫处理12 h过程中,这两个基因的表达均受PEG胁迫处理的诱导;在ABA(100μmol·L-1)胁迫处理72 h过程中,在处理6~24 h期间,CsFAD2的表达量显著升高,而CsFAD6的表达不受ABA处理的影响,CsFAD6的表达量在处理72 h时显著降低;在Na Cl(250 mmol·L-1)胁迫72 h过程中,CsFAD2的表达量全程降低,而CsFAD6在处理24~72 h期间表达量显著升高。

军曹鱼△6脂肪酸去饱和酶的cDNA序列克隆与基因表达

为了研究海水鱼合成高度不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids,HUFAs)的关键酶,本研究克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum)的△6脂肪酸去饱和酶的部分cDNA序列。根据GenBank已公布的其他鱼类的△6脂肪酸去饱和酶cDNA序列进行分析,设计了一对用于PCR扩增军曹鱼的△6脂肪酸去饱和酶基因保守序列的引物;然后以军曹鱼肝总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出一段长度为743bp的片段,该片段经纯化后,连接至pMD18-T载体上进行测序。结果显示,该片段与欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)△6脂肪酸去饱和酶基因的覆盖区同源性为90.4%,该蛋白结构含有2个组氨酸保守区(HDFGH和HFQHH)和2个跨膜结构域,具有典型的△6脂肪酸去饱和酶结构特点。通过荧光定量PCR(Real-time quantityPCR,RTQ-PCR)检测该基因在军曹鱼幼鱼不同组织中的表达量,发现△6脂肪酸去饱和酶基因在军曹鱼脑的表达量最高;其次是肝;再其次是心、肠、脾、肾、鳃;而肌肉和皮肤的表达量相对较低,在脂肪组织中没有检测到△6去饱和酶基因的表达。结论为,军曹鱼具有合成HUFAs的关键酶—△6脂肪酸去饱和酶,在其所有组织中以脑之含量最多。

鳜鱼(Siniperca chuatsi)脂肪酸去饱和酶和延长酶基因全长cDNA序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肝脏中控制高不饱和脂肪酸合成的脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)和脂肪酸延长酶(fatty acid elongase,ELO)基因的全长cDNA序列。FAD基因的全长cDNA序列1882bp,编码445个氨基酸,该蛋白序列含有FAD全部的特征结构区,包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素b5结构域,与其它鱼类FAD氨基酸序列的同源性为66.5%-90.1%,系统树分析显示其与欧洲鲈鱼和金头鲷等海水鱼类的亲缘关系最近。获得的ELO基因全长cDNA序列1401bp,编码294个氨基酸,该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构,与其它几种鱼类ELO氨基酸序列的同源性为71.8%-86.7%,系统进化分析显示其与南方蓝鳍金枪鱼和金头鲷的亲缘关系较近。鳜鱼FAD和ELO基因全长cDNA序列的获得可为进一步研究其HUFA合成能力及调控机理奠定基础。

建鲤两种Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆与表达

利用逆转录PCR和RACE技术获得建鲤2种Δ6脂肪酸去饱和酶(FADs6-a,FADs6-b)的全长cDNA序列.FADs6-a基因的cDNA总长为1 966 bp,开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸;FADs6-b基因的cDNA总长为1 931 bp,开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸.FADs6-a和FADs6-b基因都包括N端细胞色素b5结构域、3个富含组氨酸的结构域和2个推测的跨膜区,具有典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点.氨基酸同源性分析显示,建鲤FADs6-a和FADs6-b与斑马鱼的相似性较高,而与海水鱼类的相似性较低,与人类FADs6的相似性高于与FADs5的相似性.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测该基因在建鲤幼鱼不同组织中的表达量,发现2种Δ6脂肪酸去饱和酶基因在建鲤肝脏的表达量最高,其次是肠、脑、肌肉、心和肾,而前肠高于后肠,FADs6-a的表达量高于FADs6-b.得到的结论是,建鲤具有2种类型的合成高度不饱和脂肪酸(HUFA)的关键酶—Δ6脂肪酸去饱和酶,在肝脏和肠道中的含量较多,且FADs6-a和FADs6-b在结构和组织的表达方面都存在差异,这为进一步研究建鲤HUFA的合成途径及调控机理奠定了基础.

红花ω3脂肪酸脱氢酶基因的分离及结构分析

采用RT—PCR和RACE（rapidamplificationofcDNAends）技术，从红花叶片中分离到2个质体类（1）3脂肪酸脱氢酶基因（CtFAD7和CtFAD8）的全长cDNA和1个微体类∞3脂肪酸脱氢酶基因（CtFAD3）的部分序列。将其在NCBI中进行序列比对，结果显示均与其他植物质体和微体‘1）3脂肪酸脱氢酶基因具有较高的相似性。氨基酸序列分析表明红花CtFAD3、CtFAD7和CtFAD8均含有3个富含组氨酸的保守结构域，分别为HDCGH、HXXXXXHRTHH和HVIHH，其中CtFAD7和CtFAD8的N-端分别含有56和27个氨基酸残基的质体信号肽序列。疏水性和跨膜分析表明，3个红花ω3脂肪酸脱氢酶氨基酸序列均包含4个疏水区域，分别跨膜1～3次。蛋白质二级结构预测结果表明，3个ω3脂肪酸脱氢酶蛋白主要由α螺旋和β折叠组成。通过对cDNA和DNA序列比较发现，CtFAD7和CtFAD8的DNA序列中均包含有7个内含子和8个外显子。各内含子的碱基序列和长度在物种间表现出丰富的多态性，在内含子出现的位置，均为该基因的保守区；而从第2#到7#外显子的长度和序列相似性在物种问非常保守。推测∞3脂肪酸脱氢酶基因的内含子对于保证基因在物种进化过程中功能的保守性起着关键作用。

小球藻Δ12脂肪酸去饱和酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的Δ12脂肪酸去饱和酶基因序列的保守区域,设计简并引物,通过RT-PCR的方法获得了小球藻NJ-7的内质网型Δ12脂肪酸去饱和酶基因(CvFAD2)的部分序列,然后采用RACE的方法分别克隆到5′片段和3′片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。该基因全长为2 032 bp,ORF为1 158 bp,编码385个氨基酸,分子质量约为44 ku。根据已经得到的CvFAD2序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FAD2氨基酸序列相比较,同源性分别为普通小球藻(Chlorella vulgaris)75%,莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)57%,石榴(Punica granatum)57%,麻疯树(Jatropha curcas)52%。系统发育分析表明,南极小球藻CvFAD2基因与真核微藻(衣藻和普通小球藻)的FAD2基因聚在一起,介于真菌与高等植物之间,并且真核微藻FAD2基因与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近。