一种快捷可靠评价链霉菌噬菌体准ФC31整合酶功能的双荧光报告系统(英文)

在NIH3T3细胞中构建了一种链霉菌噬菌体准ФC31整合酶报告系统.该报告载体同时编码红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白,与编码准ФC31整合酶的载体共转染可以反映准ФC31整合酶的活性.细胞中从红色荧光到绿色荧光的变化和百分比的变化可经流式细胞仪检出.随着转染中准ФC31整合酶表达载体的比例升高,表达绿色荧光的细胞比例上升.准ФC31整合酶表达载体和报告系统载体比例在10∶1时,可达最高约90%的红绿荧光转变率.这表明该准ФC31整合酶报告系统提供了一种在细胞中快捷可靠的评价准ФC31整合酶功能的方法.

фC31位点特异性整合酶系统研究进展

介绍了фC31重组酶作用机制、фC31整合酶在基因治疗及其转基因动物研制中的应用、фC31整合酶催化效率的影响因素,以及фC31整合酶整合的安全性。实验证实,фC31-int可作用于多种动植物细胞及组织,将目的基因特异地整合到宿主基因组,使目的基因得以持续、高效地表达。近年来该酶在哺乳动物体内和体外的研究进展表明,фC31整合酶已经成为研究转基因、基因治疗及基因修饰的一种重要工具。

卵母细胞特异表达φC31整合酶载体pZP3-INT的构建及其在小鼠卵母细胞中的表达

链霉菌噬菌体φC31整合酶是一种位点特异性重组酶(Site-specific recombinase,SSR),可介导链霉菌噬菌体attP位点(Phage attachment site)和链霉菌基因组attB位点(Bacterial attachment site)间的单向重组。为探讨它能否应用于卵母细胞特定基因的重组,文章采用卵巢针刺取卵法采集生发泡(GV)期小鼠卵母细胞,将卵透明带糖蛋白3(ZP3)启动子驱动的φC31整合酶表达载体pZP3-INT和检测φC31整合酶位点特异性重组功能的重组质粒载体pBCPB+,通过显微注射导入到小鼠卵母细胞中。培养48h后,RT-PCR检测φC31整合酶mRNA表达以及PCR检测pBCPB+载体发生重组的情况。结果表明:载体pZP3-INT在卵母细胞中表达φC31整合酶mRNA;并且pBCPB+载体发生了位点特异性重组,提示φC31整合酶在卵母细胞中可以介导位点特异性重组反应。

ФC31整合酶系统在基因治疗中的应用

基因治疗是一种极具应用前景的疾病治疗方法。作为一种非病毒载体系统，ФC31整合酶系统凭借其高效性、位点特异性与低毒性的特点，在基因治疗的应用中具有无可比拟的优势。ФC31整合酶可以介导治疗基因整合到靶细胞基因组并稳定、长期表达，目前已经在多种组织和器官的体内、离体研究中取得成功。文章着重阐述ФC31整合酶的作用机制、应用实例及优缺点，并评估了其安全性。

应用整合酶ΦC31治疗1型糖尿病的实验研究

目的 :将整合酶ΦC31和尾静脉液压法结合用于 1型糖尿病的基因治疗。方法 :应用尾静脉液压法 (hydrodynamic) ,将携带attB位点的、突变后的人胰岛素原cDNA(mhINS)表达质粒pCMV -mhINS -attB及ΦC31整合酶表达质粒 pCMV -Int同时导入STZ诱导的糖尿病小鼠体内。结果 :注射后 ,治疗组糖尿病小鼠血糖水平恢复正常并维持 4周 ,小鼠体重增加 ,血清胰岛素水平显著升高。免疫组化检测证实mhINS在小鼠肝脏有效表达。结论 :整合酶ΦC31能介导人胰岛素原cDNA在糖尿病小鼠肝脏中持续表达 ,将是糖尿病基因治疗的有用工具。