电化学发光PCR定量检测H-ras癌基因点突变

提出了一种电化学发光PCR(ECL-PCR)分析方法, 该法可用于定量检测基因点突变. 其检测H-ras癌基因PCR扩增产物的灵敏度可达100 fmol;线性范围为0.1～500 pmol. 用ECL-PCR分析法对膀胱癌组织中H-ras癌基因进行突变检测, 只需要10 μL样品, 20 min的孵育时间和30 s的采集时间, 得出20例膀胱癌样品中有7例存在点突变, 通过标准曲线方程定量计算出突变样品的量. ECL-PCR分析方法在灵敏度、线性范围、分析时间等方面都优于传统的检测方法, 是一种安全、快速、灵敏、定量检测基因点突变的分析方法.

结核菌H37Ra免疫小鼠后机体抗结核细胞免疫功能的研究

目的探讨小鼠皮内接种H37Ra后,细菌在体内的定植及机体能否产生针对结核菌的免疫力。方法用H37Ra皮内免疫小鼠后15、30、60 d,检测结核菌在小鼠体内脏器的定植;免疫后第30、60天,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后的增殖转化刺激指数、ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后IL-2、sIL-2R的表达量。结果小鼠脾、肺脏中有结核菌定植,并至少存活60 d;脾淋巴细胞30、60 d的刺激指数分别为(2.81±0.63)、(2.16±0.52),与BCG皮内接种组无显著性差异,与未免疫组有显著性差异(P<0.05);脾淋巴细胞IL-2、sIL-2R表达量分别为(126.88±8.11)、(91.26±7.29)pg/m l和(138.58±7.67)、(127.09±5.47)pg/m l,与BCG皮内接种组、未免疫组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论H37Ra免疫小鼠后能诱导机体产生特异性的抗结核免疫力,且免疫效果略优于BCG。

结核菌H37Ra在小鼠体内诱导的免疫应答

目的检测结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫和体液免疫应答水平。方法将BALB/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,分别进行免疫,免疫8周后处死小鼠,分离血清,ELISA间接法测定血清特异性抗PPDIgG抗体的水平,流式细胞分析仪检测脾脏T淋巴细胞亚群的变化。脾淋巴细胞经体外培养、PPD刺激后,MTT法检测脾淋巴细胞的刺激指数,ELISA法检测培养上清液中IFN-γ和IL-4的水平。结果H37Ra免疫小鼠血清中抗PPDIgG抗体、脾脏CD3+T细胞和CD4+T细胞的百分率、脾淋巴细胞刺激指数、IFN-γ和IL-4水平均显著高于NS对照组,但与BCG组差异无显著意义。各组间脾脏CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T比值差异均无显著意义。结论H37Ra免疫小鼠后,可以产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答,有望成为结核疫苗的候选抗原。

结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞的研究

目的:研究结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后氮氧化物的产生及细胞因子的分泌和表达情况。方法:结核杆菌H37Ra感染RAW264.7巨噬细胞株24 h后收集上清液,用Griess法检测一氧化氮(NO),化学法检测过氧化氢(H2O2)的产生,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测感染后巨噬细胞IL-12和TNF-αmRNA的表达,ELISA法检测细胞因子IL-12和TNF-α的含量。结果:结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后产生的NO和H2O2水平均显著升高,同时IL-12和TNF-α的分泌和表达也明显增加(P<0.05)。结论:结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后能产生大量的氮氧化物和抗结核细胞因子,从而产生有利于宿主的抗结核免疫应答。

结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA抗结核免疫效应的初步研究

目的:探讨小鼠皮内注射结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA后,小鼠腹腔巨噬细胞是否被激活以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达,比较研究结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA和卡介苗菌激活小鼠腹腔巨噬细胞的抗结核免疫应答过程及免疫效应。方法:用结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA、卡介苗菌和生理盐水分别皮内注射小鼠第30d、60d后,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、H2O2以及IL-12、TNF-α的表达。结果:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌表达IL-12和TNF-α,与卡介苗菌组相比较无明显差异;与生理盐水组比较差异显著(P<0.05)。结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后也能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、H2O2,与卡介苗菌组相比较无明显差异,与未免疫组比较差异显著(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA小鼠皮内接种后,能诱导小鼠腹腔巨噬细胞活化并产生较强的抗结核免疫效应,且该效应与卡介苗菌无明显差异。

结核菌H37Ra免疫小鼠后PPD刺激淋巴细胞增殖转化的探讨

目的探讨小鼠接种H37Ra后,PPD刺激鼠淋巴细胞的增殖转化情况。方法用H37Ra皮内、腹腔免疫小鼠后30、60天,检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后的转化率。结果小鼠接种H37Ra后,30天淋转率分别为21.98%(腹腔)和24.85%(皮内);60天淋转率分别为25.50%(腹腔)和25.02%(皮内),明显高于未免疫组(P<0.01);与BCG皮内免疫组比较,无显著性差异(P>0.05);H37Ra腹腔和皮内不同途径接种,淋巴细胞转化率无明显差异。结论H37Ra免疫小鼠后能诱导机体产生抗结核的免疫应答。

长期雌激素替代治疗对大鼠子宫内膜bcl-2和H-ras基因与蛋白表达的影响

目的:探讨长期雌激素替代治疗对子宫内膜bcl 2和H ras基因和蛋白表达的影响。方法:将30只5 月龄雌性SD大鼠随机分成3组:对照组(假手术+注射溶剂,n=10)、去势组(双侧卵巢切除术+注射溶剂,n= 10)和雌激素替代组(双侧卵巢切除术+注射雌二醇,n=10)。第13周处死动物,取其子宫称重,HE染色进行病 理分析,测量子宫内膜厚度。用原位杂交和免疫组织化学的方法检测子宫内膜bcl 2mRNA,H rasmRNA及Bcl和 H ras蛋白的表达。结果:去势组子宫湿重、内膜厚度均低于假手术组(P<0.01)和雌激素替代组(P<0.01)。替 代组出现1例单纯性增生和1例鳞状细胞化生。替代组bcl 2和H rasmRNA和Bcl和H ras蛋白表达量明显高于 去势组(P<0.01),与假手术组差异无统计学意义。结论:长期雌激素替代治疗能抑制子宫内膜萎缩,且会出现单 纯性增生或鳞状细胞化生,具有潜在增加子宫内膜癌的发病风险。雌激素可通过增加bcl 2和H rasmRNA及Bcl 和H ras蛋白的表达,抑制子宫内膜细胞的凋亡,促进细胞增殖。

妊娠早期小鼠子宫内膜原癌基因H-ras的表达

目的 :本实验检测原癌基因 H-ras的转录和翻译水平在妊娠早期小鼠子宫内膜的表达规律。方法 :采用反转录聚合酶链反应 ( RT-PCR)、免疫转移印迹 ( Western-blot)和免疫斑点印迹 ( Dot-blot)法。结果 :原癌基因 H-ras在妊娠早期小鼠子宫内膜的表达呈现两个峰值 ,分别为妊娠的第 1和第 6、7天。结论 :提示原癌基因

活菌H37Ra与灭活菌H37Rv感染小鼠腹腔巨噬细胞的实验研究

目的:探讨小鼠腹腔接种结核分枝杆菌活菌H37Ra、灭活菌H37Rv后,诱导巨噬细胞免疫物质的表达差异,探讨活菌H37Ra及灭活菌H37Rv作为新的结核候选疫苗的可行性。方法:分别培养BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞,用活菌H37Ra,灭活菌H37Rv感染10小时后用抗酸染色方法,观察各组巨噬细胞吞噬情况并计算吞噬率。将活菌H37Ra、灭活菌H37Rv、生理盐水分别接种BALB/c小鼠腹腔,免疫30天后取小鼠腹腔巨噬细胞,RT-PCR法检测小鼠腹腔巨噬细胞IL-12P40、TNFα-、IFNγ-的基因转录水平;ELISA法检测细胞因子IL-12P40、TNFα-、IFNγ-的表达;Griess法、化学法检测小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO、H2O2水平;流式细胞仪检测IFNγ-诱导的CD40L的变化情况。结果:巨噬细胞对活菌H37Ra和灭活菌H37Rv的吞噬率分别为(55.71±8.42)%、(14.82±2.12)%。与灭活菌相比,活菌H37Ra有更强的被吞噬能力(P<0.01)。活菌H37Ra免疫小鼠腹腔巨噬细胞后能显著诱导巨噬细胞的IL-12P40、TNF及IFNγ-基因的转录;细胞因子IL-12P40、TNFα-、IFNγ-、NO及H2O2高水平分泌;同时活菌H37Ra刺激IFNγ-诱导的巨噬细胞表面CD40L的高表达。结论:活的结核分枝杆菌H37Ra能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生更多的保护性免疫物质,有利于免疫应答,有可能作为新的结核候选疫苗,而灭活菌H37Rv不能显著激活小鼠腹腔巨噬细胞分泌保护性免疫物质,不宜作为新的结核候选疫苗。

PCR-SSCP分析法检测宫颈癌中H-ras、p^(53)基因突变与HPV感染

我们对40例宫颈癌活检组织同时进行HPV、H－ras、p53基因的检测，应用GP－PCR技术检测了多型HPV的感染，发现阳性率为85％（34／40）。HPV16转化基因E7占61．8％（21／34）。此外，利用PCR－SSCP（单纯DNA构象多态性）分析方法，对宫颈癌中H－ras、p53基因点突变进行了检测，H－ras突变占22．5％（9／40），p53占2．5％（1／40），而H－ras突变在HPV感染阳性组织中占14．7％（5／34），其中3例的病程分期为Ⅲ期以上。结果表明：HPV16E7转化基因在宫颈癌的致癌过程中为关键基因，H－ras突变很可能与有关报道相一致，属于“迟发”事件，与肿瘤的恶性程度及浸润有关。而p535—6外显子基因突变在HPV感染的宫颈癌中发生率很低。

肾脏移植后慢性移植物肾病相关基因C-H-ras、TGF-β_1、HSP70和HSP90的表达

目的探讨肾脏移植后慢性移植物肾病（CAN）相关基因C-H-ras、TGF-β1、HSP70及HSP90的表达及其意义。方法实验分为3组：正常对照组10例，为正常肾脏标本；术中穿刺组10例，为肾脏移植术中复流40～60min后的移植肾穿刺标本；CAN组8例，为木后1～7年CAN患者肾组织穿刺标本。采用免疫组织化学及原位杂交法对每例标本行C—H—ras、TGF-β1、HSP70及HSP90蛋白和mRNA表达水平检测。结果术中穿刺组HSP70表达水平最高，CAN组C—H—ras、TGF-β1及HSP90表达水平最高。结论c—H—ras和TGF-β1两种基因的共同高表达与CAN的发生发展关系密切。调控相关基因的表达可能有助于延缓和治疗CAN。

H-ras干扰性RNA对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤CD44V6表达的影响

目的应用重组质粒pshRNA/H-ras转染卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠,观察Ras信号传导通路中信号分子的变化。方法选用裸鼠20只建立卵巢癌裸鼠皮下成瘤模型,分别设立对照组和实验组,应用陡脉冲电转重组质粒pshRNA/H-ras于瘤体中,于治疗后21天处死裸鼠并取瘤体组织固定,免疫组织化学SP法检测CD44V6的表达。结果对照组细胞膜、浆中见变异型细胞黏附分子44(CD44V6)的阳性表达,而转染pshRNA/H-ras实验组CD44V6的表达显著下降,差异有统计学意义(P＜0．05)。结论H-ras的小干扰性RNA可下调与肿瘤转移相关基因的表达,对阻止肿瘤侵袭转移具有较好的研究价值。

乙肝病毒X蛋白增加HepG2细胞ras表达

目的:研究转染乙肝病毒X基因后HepG2肝癌细胞H-ras表达的变化,以及拉米夫定是否能抑制其表达。方法:采用细胞免疫化学法、Westernblot技术检测乙肝病毒X蛋白对HepG2细胞以及核苷类似物拉米夫定对转染有乙肝病毒X基因的HepG2x细胞H-ras表达的影响。结果:X蛋白能增加HepG2细胞胞浆内H-ras表达,其面积光密度值较转染前明显增加(P<0.01),4.36×10-4mol/L拉米夫定能降低HepG2x细胞H-ras蛋白表达,其蛋白条带面积灰密度值明显低于对照(P<0.01),但拉米夫定不影响HepG2细胞H-ras表达(P>0.01)。结论:X蛋白上调肝癌细胞H-ras表达,提示可能促进HepG2细胞恶性转化。拉米夫定能抑制H-ras表达,提示拉米夫定可能遏制X蛋白的致癌作用。

突变K-ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响

目的:构建含12密码子点突变的K-ras基因siRNA腺病毒载体,并研究其对人肺腺癌细胞株H441中突变K-ras基因表达的影响。方法:首先构建含有K-rasV12 siRNA的人H1启动子真核表达载体pSilencerH1/siK-rasV12;利用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切将人H1载体启动子和K-rasV12 siRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,形成转移质粒pAdTrack-H1/siK-rasV12,然后与腺病毒骨架质粒pAd/PL共转染至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切、序列鉴定。提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒AdH1/siK-rasV12,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染人肺腺癌H441细胞株,采用Westernblot检测感染前后K-rasV12蛋白表达水平的变化,观察AdH1/siK-rasV12对人肺腺癌细胞K-rasV12表达的影响。结果:成功构建K-rasV12s iRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制H441细胞中K-rasV12蛋白的表达。结论:构建的AdH1/siK-rasV12腺病毒能有效抑制突变K-ras基因在人肺腺癌细胞株H441中的表达,为肺癌的基因治疗提供了新的方法和材料。

结核分枝杆菌H37Ra免疫小鼠后细菌在体内定植的研究

目的:了解H37Ra(人型结核分枝杆菌标准无毒株)免疫小鼠后在体内生长情况。方法:将H37Ra和BCG分别皮内接种C57BL/6小鼠,免疫后15天、30天及60天,取稀释小鼠脾脏和肺脏匀浆接种罗氏培养基,培养18天后计菌落数(CFU)。结果:免疫后15天、30天及60天,H37Ra在小鼠脾脏、肺脏定植的平均Log10CFU为1.95、1.57、2.54和1.37、1.08及0.94;BCG在小鼠脾脏、肺脏定植的平均Log10CFU则为1.72、1.39、1.06和1.16、0.96及0.50。免疫后15天及30天,脾脏及肺脏定植的H37Ra和BCG无显著性差异(P>0.05);免疫后60天,脾脏及肺脏定植的H37Ra显著多于BCG(P<0.05)。H37Ra和BCG在脾脏定植的细菌数显著多于肺脏(P<0.05)。结论:H37Ra在C57BL/6小鼠体内至少可以存活2个月。

RNAi沉默卵巢癌耐药细胞株SKOV3/ADM内源H-ras基因表达对细胞增殖能力的影响

目的:构建靶向于卵巢癌耐药细胞株中高表达的H-ras癌基因的短发夹状RNA重组质粒,研究它对卵巢癌耐药细胞株SKOV3/ADM内源H-ras基因表达的抑制作用以及H-ras基因与卵巢癌发生和耐药的关系。方法:运用基因克隆技术构建靶向于H-ras基因的重组质粒pshRNA/H-ras并转染至卵巢癌耐药细胞株SKOV3/ADM,通过W est-ern blot、RT-PCR检测H-ras蛋白的表达及mRNA转录水平的变化;MTT法检测它对SK-OV3/ADM细胞增殖的抑制作用,AO/EB实验检测pshRNA/H-ras对SKOV3/ADM细胞凋亡的影响。结果:构建的两重组质粒pshRNA/H-ras1、2均能明显抑制H-ras基因的表达。蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒pshRNA/H-ras1、2的SKOV3/ADM细胞靶蛋白的抑制率分别为86.87%和92.21%,RT-PCR检测到H-ras基因mRNA转录水平下降;pshR-NA/H-ras1、2明显抑制SKOV3/ADM细胞的增殖,MTT检测转染48h后的抑制率分别为62.4%和47.9%,AO/EB实验观测到转染24h和48h的细胞凋亡率分别为20.3%和35.6%。结论:H-ras基因在耐药的卵巢癌细胞增殖与凋亡过程中发挥作用,重组质粒pshRNA/H-ras可有效地抑制SKOV3/ADM细胞内源H-ras基因的表达和mRNA的转录,并抑制细胞的增殖和促进凋亡的发生,为化疗耐受的肿瘤细胞提供了新的基因治疗手段。

结直肠癌中CDX2、p21H-ras、p21WAF1表达的临床意义

背景：CDX2与肠源性肿瘤的发生密切相关，而p21表达减低或缺失可能是结直肠癌发生、发展中的一个普遍事件。目的：探讨结直肠癌中CDX2、p21^H-ras、p21^WAF1表达的相关性和临床病理意义。方法：收集45例临床病理资料完整的结直肠癌手术切除标本，以免疫组化方法检测癌组织和相应癌旁组织中的CDX2、p21^H-ras、p21^WAF1蛋白表达。结果：结直肠癌组织中CDX2、p21^H-ras、p21^WAF1阳性率分别为86．7％、68．9％和35．6％，相应癌旁组织中阳性率分别为100．0％、37．8％和51．1％，CDX2和p21^H-ras在癌组织和癌旁组织中的阳性率差异有统计学意义（P=0．026和P=0．006）；半定量分析结果显示CDX2和p21^WAF1在癌组织和癌旁组织中的表达水平差异有统计学意义（P=0．007和P=0．005）。癌组织中CDX2与p21^WAF1的表达存在相关性（rs=0．501，P=0．000）。DukesA、B期患者癌组织p21^WAF1阳性率显著高于C、D期患者（P=0．016），有淋巴结转移者p21^WAF1阳性率显著低于无淋巴结转移者（P=0．048），CDX2、p21^H-ras的表达与结直肠癌各临床病理特征均无相关性。结论：CDX2、p21^H-ras、p21^WAF1表达改变可能与结直肠癌的发生、发展相关。

能量可控陡脉冲联合H-ras干扰性RNA治疗卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的实验研究

目的 利用陡脉冲电场的可逆性电穿孔电转基因,观察陡脉冲治疗仪联合基因治疗对肿瘤生长的影响。方 法 构建抗H- ras基因表达的小发夹状RNA重组质粒载体(pshRNA H- ras);建立卵巢癌荷瘤裸鼠模型,光、电镜观察陡脉 冲对肿瘤组织的病理学改变,荧光报告质粒观察陡脉冲电场的可逆性电穿孔;实验分为4组:对照组、陡脉冲治疗组、陡脉 冲加基因单次干扰治疗组和加基因重复干扰治疗组,记录治疗后21d各荷瘤鼠肿瘤的体积和体质量。结果 陡脉冲对肿 瘤组织有明显的破坏作用,肿瘤边缘残存有活性的癌细胞;各治疗组肿瘤体积与体质量明显低于对照组,差异具有极显著 性(P<0.01),其中,陡脉冲加基因重复干扰治疗组肿瘤体积和重量显著低于仅用陡脉冲治疗组(P<0.01)。结论 陡脉 冲是一种新型有效的治癌工具,联合基因治疗能更有效地抑制肿瘤生长。

nm23-H_1和H-ras基因在大肠癌中的表达及其与淋巴结转移的关系

目的:探讨nm23-H_1和H-ras基因对大肠癌淋巴结转移的预测价值。方法:采用原位分子杂交法检测57例大肠癌组织中nm23-H_1、H-ras的表达状况。结果:nm23-H_1的阳性表达率为42.1％(24/57),H-ras阳性表达率为61.4％(35/57),与组织学分类无相关性;Dukes A+B组的nm23-H_1表达率显著高于C+D组(P<0.05),而H-ras则相反。结论:nm23H_1和H-ras基因的表达率与大肠癌淋巴结转移率分别呈正负相关(P<0.005),可用于淋巴结转移状况的预测,nm23-H_1的灵敏度为82.8％(24/29),H-ras的灵敏度为79.3％(23/29),联合检测则可相对提高预测的灵敏度(87.5％)。

乳腺不典型增生组织中Hras基因突变的检测

目的 :探讨H ras基因在乳腺癌发生早期的作用。方法 :用PCR RFLP和PCR SSCP方法检测 30例乳腺癌、36例单纯性增生、31例不典型增生组织中H ras基因第 12密码子的突变 ,用免疫组化技术检测乳腺癌和乳腺增生病组织中H ras蛋白的表达。结果 :73 3%的乳腺癌和 48 4%的乳腺导管不典型增生组织有H ras蛋白表达 ,单纯性增生上皮中无表达 ,所检测的增生病和乳腺癌组织中均未见到H ras基因第 12密码子突变。结论 :H ras蛋白过表达出现于乳腺癌发生的早期阶段 ,但这种过表达与H ras基因第 12密码子突变无关。