NAC类转录因子在‘砀山酥梨’黄化叶复绿过程中的表达分析

为探讨NAC转录因子在梨缺铁黄化叶复绿过程中的表达特性,筛选响应该过程的核心NAC因子,以清水处理正常梨树叶片(N)和黄化梨树叶片(C)为对照(C_(N)和C_(C)),探讨外源0.2%FeSO_(4)溶液对梨缺铁黄化叶Fe^(2+)积累的影响,研究其关键PbrNAC基因的生物学性质、组织表达特异性以及复绿过程中的表达模式,阐述其与叶内Fe^(2+)积累的关联性。结果表明,(1)于N和C内共鉴定到含NAM结构域的21个显著差异表达的PbrNAC基因,涉及8个亚族,其长度不均,motif数从4~9不等,内含子数较少;(2)该基因倾向于根中表达,且均可响应缺铁黄化叶的复绿,其中Pbr032231.1、Pbr021393.1、Pbr026635.1、Pbr038615.1、Pbr019210.3、Pbr019212.1、Pbr002372.1这7个基因在C_(C)内的表达量显著低于C_(N)内表达量,且FeSO_(4)处理后,各时期表达量均较C_(C)显著上调;与之相反,Pbr007284.1、Pbr016205.1、Pbr007673.1等14个PbrNAC基因均在C_(C)内显著高表达,而FeSO_(4)处理后,各时期表达量总体较C_(C)显著下降;(3)各叶样内Fe^(2+)含量与Pbr007284.1、Pbr016205.1、Pbr007673.1基因的表达量均呈显著负相关,且该3个基因表达与Pbr016932.1、Pbr027956.1、Pbr029956.1、Pbr026635.1等基因表达显著相关;(4)多数PbrNAC在正常梨树根系和黄化梨树根系中的表达趋势与其在C_(N)和C_(C)内的表达趋势基本一致,说明其在地下部根系与地上部叶内可能存在表达协同性。以上结果表明,梨PbrNAC基因可能与梨树缺铁胁迫响应和缺铁黄化叶的复绿相关,其中Pbr007284.1、Pbr016205.1、Pbr007673.1可能起重要调控作用。

紫檀芪乳油制剂的研制及其对砀山酥梨虎皮病的控制效果

【目的】植物天然抗氧化物紫檀芪(pterostilbene,Pte)在抑制果实病害方面具有重要的作用,但在处理果实时由于缺少乳化剂导致水溶液不稳定,很难在果实中展着和吸附,从而影响药效发挥。旨在研制紫檀芪乳油制剂(pterostilbene emulsifiable,Pte EC)以提高原药药效并研究其对砀山酥梨虎皮病的控制效果。【方法】以紫檀芪为有效成分,对其制剂进行溶剂、乳化剂筛选,并对乳油的质量进行测定,确定最佳配方。在此基础上以砀山酥梨为试材,研究二苯胺(diphenylamine,DPA)、Pte和Pte EC对冷藏[温度(-1±0.5)℃,湿度90%~95%]和货架期果实品质的影响。【结果】10%紫檀芪乳油制剂的最佳配方为10%紫檀芪+10%吐温20+80%无水乙醇。DPA、Pte和Pte EC处理均可较好保持冷藏期间梨果实硬度等指标,同时能有效抑制冷藏期间梨果皮H_(2)O_(2)、丙二醛和共轭三烯的积累,从而抑制虎皮病的发生。冷藏至210 d时,DPA、Pte和Pte EC处理组发病率分别比对照组低28.69%、12.19%和15.32%,且Pte EC对梨虎皮病的控制效果仅次于DPA,较Pte处理效果好。【结论】Pte EC优于Pte,且绿色安全,能有效控制砀山酥梨虎皮病的发生,值得进一步进行商业应用的推广示范。

1-MCP和DPA对砀山酥梨黑皮病的抑制效果

【目的】探讨1-MCP和DPA对砀山酥梨黑皮病的抑制效果及其可能的机理,为梨的黑皮病控制提供技术参考和理论依据。【方法】以砀山酥梨为材料,在果实冷藏(2±0.5℃)前,分别采用1000μL.L-1、2000μL.L-1的DPA溶液浸泡1min和0.5μL.L-1的l-MCP气体处理12h,定期对果实部分采后生理指标进行测定,并在贮藏末期对其黑皮病发病情况进行观察统计。【结果】1000μL.L-1、2000μL.L-1的DPA溶液和0.5μL.L-11-MCP处理,显著地抑制了果皮α-法尼烯、共轭三烯、总酚、MDA的含量、细胞膜透性的增加和PPO活性的升高,并极其显著地抑制了果实在贮藏期黑皮病的发生,延迟了其在货架期的发病。【结论】采后适宜浓度的1-MCP和DPA处理,均能显著地抑制和延缓砀山酥梨冷藏期和货架期黑皮病的发生,但二者的作用机理可能不同。

‘砀山酥梨’幼果萼片脱落期内源激素含量变化

以‘砀山酥梨’为试材,利用高效液相色谱(HPLC)技术测定了果实萼片脱落期幼果果心和果顶离层部位的生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)含量,分析了果实萼片脱落关键时期内源激素变化及其与萼片脱落的关系。结果表明:果实发育初期IAA含量较高,随之下降,而萼片脱落期萼片宿存果GA3含量较高,萼片脱落果ABA含量较高。‘砀山酥梨’果实萼片脱落由多种内源激素协同调控,幼果果顶离层部位、果心低IAA和GA3水平以及果顶离层部位高ABA水平有利于果实萼片脱落,反之,利于果实萼片宿存。

砀山酥梨叶片矿质元素含量年变化及其相关性分析

以砀山酥梨叶片、梨园土壤为试材,于梨树生长期每10 d分别取样分析,测定了叶片中N、P、K、Ca、Mg、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo及土壤中全N、水解N、有效P、缓效K、速效K、交换性Ca、交换性Mg、有效S、有效Fe、有效B、有效Mn、有效Cu、有效Zn、有效Mo含量,采用SPSS软件对其进行统计分析。结果表明,砀山酥梨叶片中N、P、K、Cu含量年变化总体上呈逐渐下降趋势,Ca、Mn则呈逐渐上升的趋势,Mg、B含量年变化不大,S、Zn含量呈先下降后上升的趋势,Fe、Mo含量变化波动性较大。叶片中N含量与P、K、B、Cu含量呈极显著正相关,与Mg、S、Fe含量呈显著正相关,而与Ca、Mn含量则呈极显著负相关。土壤中N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Zn、Mo矿质元素含量的年变化与对应叶片中矿质元素含量的年变化无显著性相关。

砀山酥梨不同程度缺铁叶片生长素抑制蛋白基因表达分析

以‘砀山酥梨’为材料,采用酶联免疫分析法(ELISA),测定叶片中内源IAA的含量。依据已构建的缺铁叶片SSH文库中生长素抑制蛋白(ARP)基因片段的序列信息,应用RACE技术克隆其cDNA全长,通过实时荧光定量(qRT-PCR)技术,分析ARP基因的相对表达量。结果表明:(1)ARP基因cDNA全长为707bp,其中开放阅读框为351bp,编码116个氨基酸,推测的蛋白质分子量为12.82kD;该蛋白可能定位于微体,属于非分泌型、非跨膜蛋白类,并具有ARP基因家族的保守结构域。(2)在不同程度缺铁叶片中ARP基因的表达量存在差异,随着缺铁程度的增加,表达量显著升高,同时叶片中内源IAA含量逐渐降低。据此推测,ARP基因可能负反馈调节缺铁黄化叶片中IAA的水平,从而调控叶片的生长发育。

生长调节剂对‘砀山酥梨’脱萼果率和果实品质及新梢生长的影响

以‘砀山酥梨’为试材,于盛花期喷施不同浓度的保花保果剂(PBO)、多效唑(PP333)、氟硅唑(Flusilazole),研究生长调节剂对‘砀山酥梨’脱萼果率、果实品质和新梢生长的影响。结果表明:高浓度PBO、PP333虽能提高‘砀山酥梨’脱萼果率、果实固形物与可溶性糖含量,降低了有机酸含量,但使果实石细胞明显增多、硬度增加、果点增大。2 500 mg.L-1 PP333、2 000 mg.L-1 PBO处理果实石细胞含量分别为1.52%和1.47%;果肉硬度分别为6.34和6.36 kg.cm-2;果点直径分别为1.97和1.87 mm,均显著高于喷施清水对照。PBO和Flusilazole对果实品质和新梢生长影响较PP333小,花期喷施其适宜浓度为200 mg.L-1和100 mL.L-1。2 500 mg.L-1 PP333处理果点明显增大,超微结构观察表明,PP333处理使细胞排列紧凑、细胞壁变薄、木栓化程度提高,且表皮裂痕增大。

‘砀山酥梨’果实CCoAOMT基因的克隆与表达分析

[目的]通过克隆‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)果实中咖啡酰-辅酶AO-甲基转移酶(CCoAOMT)基因的全长序列,并对其进行生物信息学及基因表达差异分析,阐释了其在梨果实木质素合成途径的作用,以期为今后利用基因调控技术来改变果实中石细胞含量从而改善梨果实品质提供一定的理论依据。[方法]以15年生‘砀山酥梨’果实为试材,根据从NCBI数据库中搜索得到关于植物木质化的CCoAOMT基因序列与梨基因组数据库调取的序列比对,利用RT-PCR技术克隆得到了木质素生物合成途径中的一种关键酶基因PbCCoAOMT,GenBank登录号为KJ577544。[结果]该基因全长1133bp,具有1个744bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列比对及系统进化树分析表明:CCoAOMT酶是氧甲基转移酶类,与其他植物CCoAOMT编码的蛋白序列有较高的相似性,尤其与枇杷的相似度最高,达到98.79%,且亲缘关系最近。利用荧光定量PCR技术对其在果实不同发育时期表达模式的分析发现,基因表达量呈先上升后下降的趋势,与梨果实中石细胞含量的变化趋势相似。[结论]初步认为从‘砀山酥梨’中克隆得到的PbCCoAOMT基因可能参与了梨果实中木质素的代谢。

‘砀山酥梨’叶片中Fer2基因的克隆与表达分析

分别以轻度、中度和重度缺铁的‘砀山酥梨’叶片cDNA为模板,正常叶片为对照,运用RACE技术,克隆Fer2基因的cDNA全长为1 052 bp,编码区828 bp,编码276个氨基酸。采用Protparam、InterProScan和ProtFun 2.2 Server等生物学信息软件分析蛋白质理化性质和结构域特征,结果表明:Fer2与‘翠冠’梨叶片的Fer2蛋白和Fer4蛋白等具有较高的相似性,故命名该基因为PbFer2。推测蛋白质相对分子质量为3 054.3,理论等电点为5.80。通过Real-time PCR技术,分析PbFer2基因表达量,结果表明:轻度缺铁会提高PbFer2的表达量,随着缺铁程度的增加,PbFer2表达量显著下降。

‘砀山酥梨’实时荧光定量PCR内参基因的筛选

对'砀山酥梨'不同组织器官及不同非生物胁迫条件下叶片中可以稳定表达的内参基因进行筛选,为后续荧光定量PCR试验提供参考基因。分别对生长45 d的'砀山酥梨'嫁接苗进行低温、高温和盐胁迫处理,采集不同处理时间的叶片;还分别采集'砀山酥梨'4个果实发育时期的果肉(分别为花后32、65、99、143d)、叶片、成熟果皮、花粉、花柱共26个样品。利用实时荧光定量PCR技术对4个传统内参基因:β微管蛋白基因(TUB)、多聚泛素酶基因(UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)和转录延伸因子基因(EF1α),以及通过转录组数据筛选出来的3个新内参基因Cytochrome b561(CyB)、WD-repeat protein(WDP)和mRNA capping enzyme(mRCE),共计7个内参基因在26个样品中的表达差异情况进行测定。结果表明:通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper 3个软件对其表达稳定性进行分析,最终筛选出在不同组织及非生物胁迫条件下稳定表达的最优内参基因。UBQ在高温和盐胁迫处理的'砀山酥梨'叶片中表达最稳定,可作为优选内参基因;在低温胁迫处理下,TUB和WDP在'砀山酥梨'叶片中表达较稳定,可作优选内参基因;WDP在'砀山酥梨'不同组织器官中表达最稳定。不同内参基因在同一物种不同组织及胁迫处理条件下表达稳定性具有较大差异,在进行荧光定量PCR试验时,应根据具体的试验材料和方法选择最优内参基因。

1-MCP、DPA对砀山酥梨冷藏期间抗氧化能力的影响及与黑皮病发病的关系

以砀山酥梨为试材,分别采用1.0μL/L 1-甲基环丙烯(1-MCP)和2 000μL/L的二苯胺(DPA)溶液处理,对冷藏期间果皮抗氧化能力及梨黑皮病的发病情况进行研究。结果表明:1.0μL/L 1-MCP和2 000μL/L DPA处理均能显著提高冷藏过程中梨果皮SOD、POD的活性,增强果实的抗氧化性,并抑制果实总酚、丙二醛(MDA)含量和多酚氧化酶(PPO)活性,保持细胞膜的完整性,极显著地抑制果实贮藏后期和货架期黑皮病的发生,其中以1.0μL/L 1-MCP效果最好。提高果皮的抗氧化能力是防止梨黑皮病发生的有效办法。

砀山酥梨花芽分化及开花物候期观察研究

为确定砀山酥梨花芽分化时期,了解其开花过程,试验以砀山酥梨短枝顶芽为试材,采取田间摘叶法,统计花芽的生理分化时期;通过徒手切片、利用OlympusBX51显微镜拍摄记录花芽形态分化不同阶段的纵切面图片。结果表明,砀山酥梨花芽的生理分化始于6月初,持续到7月中下旬;花芽形态分化始期发生在7月下旬,9月中旬为雄蕊出现期,雌蕊出现期在10月中下旬。次年3月下旬,花芽开始膨大,经历花序伸长、花序分离、白蕾期、大蕾期、初花期、盛花期、末花期和谢花期,4月中旬,开花物候期结束。试验结果为促进砀山酥梨花芽分化、提高果实产量与品质,于花期采取适当的栽培管理措施,提供了理论依据。

‘砀山酥梨’宿萼果与脱萼果内源激素含量比较及其信号传导基因的表达差异

[目的]本文旨在探明‘砀山酥梨’宿萼果与脱萼果内源激素含量及其信号传导基因表达的差异。[方法]以‘砀山酥梨’为试材,在盛花期喷施400 mg·L^(-1)赤霉素(GA3)、200 mg·L^(-1)多效唑(PP333)溶液,于盛花后10 d,分别取对照及外源生长调节剂处理的宿萼果和脱萼果,测定内源激素生长素(IAA)、玉米素(ZR)、GA3和脱落酸(ABA)的含量。从NCBI梨基因组数据库中查询内源激素相关信号传导基因,并运用RT-qPCR技术,分析其在宿萼果与脱萼果的相对表达量。[结果]‘砀山酥梨’宿萼果中IAA和GA3含量显著高于脱萼果,而ZR和ABA含量无显著差异。宿萼果中高含量的IAA促使膜转运蛋白基因pbAUX1和核内受体蛋白基因pbTIR1高表达,生长素抑制基因pbAUX/IAA1、pbAUX/IAA2表达量显著下降,生长素响应因子pbARF1、pbARF2表达量显著上升,激活了原初反应基因pbGH3.6、pbSAUR32,调控宿萼果的发育。宿萼果中CTK膜转运蛋白基因pbCRE1/2/3/4和核内反应调节子pbARR1/11表达量均显著高于脱萼果。宿萼果核内GA受体蛋白基因pbGID1表达量显著高于脱萼果,诱导其泛素化酶体蛋白基因pbGID2和转录因子基因pbTF5的表达,参与调控宿萼果的发育。宿萼果中ABA信号传导基因pbPP2C-2、pbPP2C-50、pbSnRK2-2和pbABF-5-5表达量显著高于脱萼果。[结论]‘砀山酥梨’萼片的宿存主要受幼果内IAA、GA含量及其信号传导基因调控,且幼果内高含量的IAA、GA3有利于萼片宿存。

基于GC-MS技术测定砀山酥梨果实主要品质特征成分的代谢物谱

糖、有机酸和芳香物质的组分及其含量是组成果实品质的重要经济生物学性状,对果实的口感和风味有重要影响。采用气相色谱-质谱联用技术,对砀山酥梨成熟期果实主要品质特征成分进行检测和分析,探索并建立酥梨果实代谢谱分析中样品制备、检测以及数据处理的相关技术和方法。方法学考察结果表明,该方法具有良好的精密度、稳定性和重现性。酥梨有机相提取物的定性分析结果显示,其主要代谢物包括碳氢化合物、醇类、醛类、酮类、挥发酸类、酯类等;水相提取物的主要代谢物为糖类、糖醇、有机酸类等。本研究建立的酥梨果实主要品质特征成分的代谢谱分析技术平台,将为进一步开展酥梨果实品质相关的代谢组学研究提供实验依据。

优质中熟梨新品种‘晋早酥’的选育

山西省农业科学院果树研究所以‘砀山酥梨’为母本、‘猪嘴梨’为父本进行杂交,经过初选、复选、品种比较以及30余年在不同生态区域比较试验和生产试栽的漫长选育过程,确认育种代号为72-9-31的性状表现优良,并于2012年通过山西省农作物品种审定委员会审定,定名为‘晋早酥’。该品种与‘砀山酥梨’相比,成熟期提前10~15 d,具有果形端正、果个大、肉质细脆、石细胞少、中熟、耐贮藏和抗腐烂病能力强等优点,且其生物学性状和经济性状稳定,适宜我国北方白梨适栽区广泛栽培。