中国野生刺葡萄(Vitis davidii Foex)及其单品种葡萄酒中花旗松素含量分析

利用高效液相色谱-串联质谱联用技术对原产中国的野生刺葡萄果实的果皮、果肉、种子及单品种葡萄酒中的花旗松素含量(以鲜质量计算)进行测定与分析。结果表明:刺葡萄果实果皮中花旗松素含量最高,其含量在刺葡萄黑、白果实中分别为(2.44±0.18)、(2.03±0.14)mg/kg,在种子中分别为(1.66±0.13)、(1.38±0.12) mg/kg,果肉中含量最低,分别为(0.36±0.02)、(0.25±0.02)mg/kg。刺葡萄黑、白果实中各个部位花旗松素含量均无明显差异,但对照品种黑色果实果皮中的花旗松素含量显著高于白色果实,这说明花旗松素含量的高低与葡萄果皮颜色并无直接关系。在单品种酒中,白葡萄酒由于酿造工艺不同,果皮和种子中的花旗松素无法进入酒中,花旗松素含量仅为红葡萄酒的20%;葡萄酒中的花旗松素含量略低于果实是因为提取果实中花旗松素的溶剂是甲醇,而葡萄酒中只是水和乙醇的自然浸渍。

Oligostilbentes from Vitis DavidII

A novel tetrastilbene, davidol A, was isolated from the stems of Vitis davidii together with the previously known resveratrol, (+)-epsilon-viniferin; ampelopsin C; ampelopsin E; vitisin A and hopeaphenol. Its structure was elucidated mainly by 1D and 2D NMR analyses.

刺葡萄VdERD6L15基因克隆及功能分析

【目的】探究VdERD6L15在刺葡萄果实生长发育中的功能,从湘刺1号中克隆VdERD6L15基因及其启动子,进行基因功能研究和启动子活性分析。【方法】克隆VdERD6L15基因CDS序列,并对CDS进行生物信息学分析;构建VdERD6L15表达载体,并通过瞬时转化烟草确定VdERD6L15基因编码蛋白的亚细胞定位;同时,通过在己糖缺陷型酵母菌株EBY.VW4000中异源表达VdERD6L15探究其功能;此外,通过启动子截短试验确定VdERD6L15启动子的核心区域。【结果】成功克隆刺葡萄VdERD6L15基因编码序列,该编码序列长1461 bp,可编码486个氨基酸,具有膜蛋白特征,属于单糖转运蛋白家族。亚细胞定位试验确认VdERD6L15蛋白主要定位于液泡膜上。通过在酵母菌株EBY.VW4000中进行异源表达,验证了VdERD6L15具有转运葡萄糖的能力。利用PlantCARE数据库对VdERD6L15启动子顺式作用元件进行分析,发现其主要包含光响应元件、干旱胁迫和激素响应元件。通过GUS染色分析,进一步确定候选基因VdERD6L15启动子的关键调控区域位于-500 bp到-1000 bp之间。【结论】VdERD6L15是一个定位在液泡膜上的糖转运蛋白,具有转运葡萄糖的功能;VdERD6L15启动子的核心元件位于ATG上游500~1000 bp之间。

湖南特色刺葡萄果皮中优势次生代谢物质分析

以‘夏黑’葡萄和‘阳光玫瑰’葡萄为对照,利用超高效液相色谱质谱联用技术广泛靶向代谢组学的方法,对果皮中的次生代谢产物进行组学分析,结合统计学方法筛选出湖南省3个刺葡萄品种果皮中的差异代谢物质。结果表明:本试验共检测到737种代谢物质,其中‘湘刺1号’检测出的代谢物质有711种,‘湘刺2号’检出666种,‘湘刺4号’检出710种;不同刺葡萄品种果皮的代谢物质有较大差异,主要表现为类黄酮化合物含量的差异,其中‘湘刺2号’的原花青素相对含量较高,‘湘刺4号’的花色苷和类黄酮物质相对含量较高,‘湘刺1号’果皮中含有较多的槲皮素-3-O-桑布双糖苷、丁香亭-3-O-(6″-乙酰)葡萄糖苷、柠檬素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-芸香糖苷和锦葵色素-3-O-(6″-O-乙酰)葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷,且香豆酰阿魏酰酒石酸和紫丁香苷仅在‘湘刺1’号中检出。

刺葡萄STS基因克隆及其在不同光质下的表达水平

【目的】研究刺葡萄芪合酶(STS)基因的序列特征及其在不同光质处理下的表达水平,旨在为进一步解析STS基因通过响应光信号调控刺葡萄愈伤组织中白藜芦醇合成的分子机制提供依据。【方法】以刺葡萄愈伤组织为材料,利用逆转录PCR(RT-PCR)技术成功克隆获得了4个STS基因,对这些基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其在不同光质下和不同培养阶段的表达水平。【结果】成功地从刺葡萄愈伤组织中克隆获得了VdSTS5、VdSTS6、VdSTS20、VdSTS21共4个基因,均含1179 bp完整开放阅读框(ORF),编码392个氨基酸残基,预测其编码的是亲水性、无信号肽的细胞质定位蛋白,磷酸化修饰主要发生在苏氨酸和丝氨酸位点上,蛋白质的二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成,STS与查尔酮合成酶(CHS)的蛋白质序列具有高度同源性。4个VdSTS的蛋白质序列在系统进化树上处于3个不同的大分支中,其中,VdSTS5与VdSTS21处在不同的分支中,而VdSTS6与VdSTS20聚在同一分支中,葡萄属不同种之间的STS蛋白质序列相似度高,推测其可能具有相同的功能。启动子顺式作用元件预测发现,4个VdSTS启动子含有多个光响应元件,还含有转录因子识别和作用元件、激素作用元件等。光质显著影响4个VdSTS的表达,在白光、红光、黄光和黑暗处理下,VdSTS的总体表达水平较高,而在绿光和紫光处理下,VdSTS的总体表达水平较低;同时,VdSTS对不同光质的响应不仅存在着基因间的差异,还存在不同培养阶段的差异,VdSTS5在培养后期强烈响应黄光的调控,VdSTS6、VdSTS20在培养中期对黑暗和红光的响应最强,VdSTS21则在培养中期强烈响应红光的调控,这些基因表达水平的变化影响着刺葡萄愈伤组织中白藜芦醇的合成。【结论】4个VdSTS对光质的响应存在差异,可能在响应不同光质调控中对刺葡萄愈伤组织白藜芦醇的合成起到重要作用。

单宁辅色刺葡萄花色苷微胶囊的制备、表征及贮藏稳定性

采用单宁辅色结合微胶囊化的方法实现刺葡萄花色苷的稳态化。选取不同葡萄糖当量(dextrose equivalent,DE)值的麦芽糊精作壁材结合单宁辅色,采用真空冷冻干燥制备刺葡萄花色苷微胶囊。结果表明:DE12麦芽糊精包埋单宁辅色花色苷微胶囊(12-辅色微胶囊)的包埋率最高,达(99.23±0.31)%,其吸湿性和热稳定性也优于其他微胶囊,4种微胶囊的表面形态均呈玻璃状结构,经辅色的花色苷微胶囊的L^(*)值与a^(*)值较未辅色的高,b^(*)值较未辅色的低。差示扫描量热分析表明12-辅色微胶囊具有更高热变性温度,具有更高的热稳定性;傅里叶变换红外光谱确认了辅色花色苷被麦芽糊精成功包埋。12-辅色微胶囊具有良好的缓释性能和抗氧化能力,其在模拟胃消化液中花色苷释放率为(56.84±0.02)%,模拟肠消化液中1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率(50.15±0.38)%;降解过程符合一级动力学模型,具有较好的贮藏稳定性。同时,在刺葡萄汁加工应用中微胶囊可有效降低巴氏杀菌过程中花色苷的损失。

刺葡萄酒用种质筛选及其发酵过程中活性物质变化研究

为了挖掘适于黄河故道产区种植的刺葡萄酒用种质,该试验于2020年对郑州果树所7种刺葡萄果实品质指标(理化成分、酚类物质含量、抗氧化活性和颜色指标)进行检测和主成分分析,2021年对筛选品种刺葡萄酒和参照果酒(巨峰和马瑟兰葡萄酒、石榴酒)质量指标(基础指标、活性物质含量和抗氧化能力)进行检测分析并探究刺葡萄酒发酵过程中活性物质含量变化规律。结果表明,湘珍珠红叶刺葡萄果实体积小、偏红色色调且饱和度更高,皮果比、可溶性固形物和酚类物质含量以及抗氧化活性均处于最高水平;湘珍珠红叶刺葡萄酒酒精度、活性物质含量和抗氧化能力均高于本土鲜食水果酿制的巨峰葡萄酒和石榴酒,其总酚、总黄烷醇和总花色苷含量以及DPPH清除力显著高于欧亚种马瑟兰葡萄酒;发酵结束时,刺葡萄酒花色苷和黄烷醇含量仍处上升趋势,后续可对浸渍条件持续优化。综上所述,湘珍珠红叶刺葡萄作为酒用品种适于在黄河故道产区推广种植。

刺葡萄类钙调蛋白基因VdCML8克隆与表达分析及其启动子转录活性测定

【目的】克隆刺葡萄类钙调蛋白基因VdCML8基因及其启动子序列,并对VdCML8基因进行表达分析,对其启动子进行转录活性测定,为深入探究该基因在葡萄抗炭疽病中的生物学功能提供理论参考。【方法】以刺葡萄紫秋为材料,采用RT-PCR技术克隆VdCML8基因及其启动子序列,对VdCML8蛋白的理化性质和二级结构进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR检测刺葡萄紫秋和欧洲葡萄红地球CML8基因在接种胶孢炭疽菌及外施水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)处理后的表达特征,通过构建β-葡萄糖苷酶(GUS)融合载体转化烟草进行转录活性检测。【结果】VdCML8基因的开放阅读框(ORF)长度为450 bp,编码149个氨基酸残基,具有EF-hand结构域,其二级结构中α-螺旋占65.10%,延伸链占4.70%,无规则卷曲占20.13%,β-转角占10.07%,该蛋白定位于细胞膜中。由系统发育进化树可知,刺葡萄VdCML8蛋白与欧洲葡萄VvCML8和河岸葡萄VrCML8的亲缘关系较近。VdCML8基因的启动子序列(pVdCML8)长度为1050 bp,除含有大量的CAAT-box和TATA-box外,还含有一些光响应元件(L-box、chs-CMALa和TCT-motif)、脱落酸(ABA)响应元件(ABRE)、厌氧诱导响应元件(ARE)、防御和应激元件(TC-rich repeats)、伤害响应元件(WUN-motif)等。构建pVdCML8的瞬时表达载体pVdCML8::GUS,瞬时转化烟草后发现pVdCML8具有转录活性,且能驱动VdCML8基因表达。在接种胶孢炭疽菌后,刺葡萄紫秋VdCML8基因和欧洲葡萄红地球VvCML8基因表达均上调,均在接种后12 h达峰值,二者的相对表达量是对照组(清水处理)的22.08和9.30倍。SA处理3 h时,VdCML8基因的相对表达量是对照组的7.68倍,是VvCML8基因的2.76倍。JA处理6 h时,VdCML8基因达峰值,是对照组的22.25倍,是VvCML8基因的9.04倍。【结论】VdCML8基因是SA和JA信号途径的下游调控基因,SA和JA可诱导其高效表达,参与葡萄炭疽病响应过程,对提高植株抗病性具有一定作用。

酶促酰化对刺葡萄锦葵啶花色苷光稳定性的影响

提高花色苷的稳定性对扩大其应用意义重大。本研究以刺葡萄花色苷为对象,采用脂肪酶CAL-B酰化,对比分析不同酰化花色苷的光稳定性及光降解动力学特性,探索酰基结构及光源对花色苷稳定性的影响。结果表明:在未酰化、酶促酰化(酰化率49.9%)、内源酰基花色苷三个样品中,内源酰基、外源酰基样品的稳定性均高于未酰化样品;避光后内源酰基的花色苷含量最高。三个样品的光降解反应符合动力学零级模型,其回归系数均大于0.980。在避光条件下,内源酰基、酶促酰化、未酰化三个样品的半衰期t_(1/2)分别为240、141、72.4 d;反应速率常数k_(0)分别为0.0499、0.0851、0.162。目前酶促酰化样品的光稳定性稍低于内源酰基,如能进一步提高酰化率,酶促酰化可为花色苷的稳定性及应用提供重要价值。

不同酵母发酵对紫秋葡萄酒品质的影响

为提升紫秋葡萄酒品质,采用扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera,SF)与异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,WK)作为紫秋葡萄酒发酵菌株,并检测发酵过程中微生物数量变化、发酵后葡萄酒的理化指标、有机酸与挥发性成分。结果表明:在混菌发酵过程中WK的生长受SF的抑制且发酵结束后酒精度显著低于安琪果酒专用酵母单菌发酵的葡萄酒。WK+SF发酵的葡萄酒花青素与总酚含量最高,分别为3.31 mg/L与454.31 mg/L;总酸与还原糖含量较低,均为6.39 g/L;酒石酸、乳酸、柠檬酸与苹果酸含量分别为1 058.00、102.60、256.44、91.08 mg/L。混菌发酵的葡萄酒整体感官较单菌发酵高,其中WK+SF发酵的葡萄酒整体感官较好,具有玫瑰、紫罗兰等的花香与香蕉、菠萝等的果香,但存在酒精度相对较低、发酵香相对较弱的问题。在6种葡萄酒中共检测出46种挥发性成分,其中30种为共有成分,WK+SF发酵的葡萄酒挥发性成分种类、酯类与醇类物质含量均为最高,分别为45种、259 024.73μg/L与319 170.16μg/L,主成分分析发现不同酵母发酵的葡萄酒风味有较大差异,累计方差贡献率为82.8%。综上所述,采用混菌发酵方法能显著提高紫秋葡萄酒品质,可对紫秋葡萄酒的生产提供基础理论数据支撑。

刺葡萄0943抗白腐病转录因子VdWRKY49的克隆及序列分析

【目的】获得来源于中国野生抗病种质刺葡萄0943的转录因子Vd WRKY49基因,揭示其序列特征、基因功能与抗葡萄白腐病之间的关系,初步揭示抗病种质抗病机制。【方法】利用同源克隆的方法分别获得刺葡萄0943的转录因子Vd WRKY49基因的编码区和启动子区域,分析其序列特征,通过实时荧光定量检测其对白腐病菌和水杨酸诱导的反应,同时以感病品种欧亚种‘黑比诺’为对照,分析不同种质中的转录因子Vd WRKY49基因序列及表达差异。【结果】来源于中国野生种质刺葡萄0943的Vd WRKY49基因,在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列特征和位点特征,同时也存在不同,在DNA和氨基酸水平上与来源于欧亚种的‘黑比诺’Vv WRKY49有差异,这些差异可能造成了其结构功能的差异;受到葡萄白腐病和水杨酸诱导后,Vd WRKY49基因的表达量明显高于Vv WRKY49。【结论】来源于刺葡萄0943的Vd WRKY49基因受到白腐病菌和水杨酸诱导后表达量和表达模式明显区别来源于‘黑比诺’的Vv WRKY49基因,推测在葡萄抗病途径中转录因子WRKY49具有重要的生物学作用。

刺葡萄渣的可持续性绿色加工的研究进展

近年来,从刺葡萄渣等食物垃圾中回收有价值的化合物是食品行业的一个新问题。刺葡萄渣是葡萄酒工业经过压榨和发酵过程后产生的一种重要的固体废物,造成污染及经济损失。刺葡萄渣由10%~30%的碎葡萄和其他营养成分(如未发酵的糖、多酚和天然色素等)组成。通过最合适的提取工艺回收这些化合物,并能够在不影响产品稳定的情况下实现产量最大化。刺葡萄渣具有巨大的潜在价值,在酿酒厂及其他食品行业中仍有技术有待采用与开发。通过阐述酶辅助提取法、固液萃取法、超临界流体萃取法等提取技术,综述刺葡萄渣的抗菌、抗氧化、抗癌等作用,以及可加工成动物饲料、膳食纤维片剂等应用价值。

比较荧光分光光度法和紫外-可见分光光度法检测刺葡萄叶片总黄酮含量

根据黄酮类化合物能与铝离子形成稳定荧光络合物的原理,采用改进单纯形法优化最佳测定条件,提出基于荧光光谱的刺葡萄叶片总黄酮含量的测定方法,并与测定黄酮类化合物含量常用的紫外-可见分光光度法进行了比较。研究结果显示,荧光分光光度法测定刺葡萄叶片总黄酮含量的最佳条件为:pH值为4.9的乙酸-乙酸钠缓冲溶液2.5 mL,76%的乙醇,正丁醇为5.7 mL,5.7%的硝酸铝溶液为1.5 mL。本方法标准曲线的决定系数为0.999 6,回收率为100.72%,精密度的相对标准偏差为1.00%,重现性的相对标准偏差为1.16%,检出限为0.54μg/L。

葡萄新品种‘紫秋’

从野生刺葡萄资源中选育出的新品种‘紫秋’,植株生长势强,适应性强,耐旱、耐粗放栽培,抗病性强,适合南方高温、多湿气候条件,而且结果早,产量高,果实味甜,风味好,市场上颇受欢迎。

刺葡萄花粉形态观察

【目的】探讨野生刺葡萄(Vitis davidii Foёx)的遗传多样性、各类型之间的亲缘关系及演变关系。【方法】利用扫描电镜对25份野生刺葡萄的花粉形态特征进行系统观察和分析。【结果】除供试材料澧县雌能花花粉形状不规则外,其他材料花粉粒为超长圆球形和长圆球形;两性花与雄能花具3条萌发沟;花粉粒极轴长变化为23.05~31.95μm,变异系数7.71%,赤道轴长变化为12.85~20.60μm,变异系数10.36%;花粉外壁极面纹饰呈穴状、网状、疣状及2者间的过渡状态。【结论】基于花粉粒由大到小的演化顺序,将刺葡萄各类型分为3类;刺葡萄花粉粒极面纹饰的演化趋势为:穴状-网状-疣状。刺葡萄花粉极面外壁纹饰的差异与花粉粒大小可作为研究其遗传多样性、亲缘性关系与演变进程的依据。

刺葡萄化学成分的研究

目的 :对刺葡萄中的二苯乙烯化学成分进行研究。方法 :大孔吸附树脂正、反相硅胶柱色谱分离 ,光谱数据鉴定结构。结果 :分离并鉴定了 6个化合物 ,resveratrol,heyneanolA ,ampelopsinE ,amurensinB ,(+) ε viniferin ,vitisinA ,amurensinG。结论

秋水仙素对刺葡萄植株形态的影响

以经秋水仙素处理后加倍的四倍体剌葡萄植株为试材,观察其叶片形态、枝蔓节间长度与粗度、叶片气孔、棚栏组织等的变化.结果表明,与二倍体相比,四倍体植株的叶片变厚,叶形指数变小,叶色变深,叶表面皱缩粗糙,节间变短,植株变矮;叶片气孔密度减小,保卫细胞增大,叶片栅栏组织增厚.

超临界CO_2萃取刺葡萄籽油及其成分分析

以刺葡萄种子为原料,采用单因素试验和正交试验设计,研究了超临界CO2萃取刺葡萄籽油的工艺,并用气相色谱-质谱联用仪对刺葡萄籽油的化学成分进行了分析.结果表明,超临界CO2萃取刺葡萄籽油的适宜工艺条件为:种子粉碎粒径0.40～0.53mm,萃取压力30MPa,萃取温度35℃,分离温度55℃,分离压力12MPa,在此条件下油脂萃取率为13.5%.GC/MS分析显示,刺葡萄籽油成分以脂肪酸为主,其中不饱和脂肪酸含量占87%,不饱和脂肪酸主要以亚油酸为主,含量为82.32%;饱和脂肪酸主要为硬脂酸和棕榈酸,相对含量分别为9.03%,3.26%.

基于SRAP标记的刺葡萄亲缘关系分析

运用SRAP标记对分布在湖南省内的21份刺葡萄资源进行遗传多样性与亲缘关系分析。结果表明:从84对SRAP引物组合中筛选出的7个引物组合中共扩增出61条带,其中有34条稳定的多态性条带,多态性比率为55.7%;运用NTSYS软件计算出21份材料的成对遗传相似系数为0.80～0.99,在遗传相似系数0.92处可将全部材料划分为3个类群;UPGMA聚类分析表明,在湖南省境内分布的刺葡萄有6个基本类型,并推测出了农大1号至农大9号育种材料(2003年由湖南农业大学运用秋水仙素处理不同地区刺葡萄种籽得到的诱变材料,由于经过3次搬迁,现已遗失亲本档案)的亲本。

钾对刺葡萄光合作用的影响

以刺葡萄为材料,设不同施钾量(0、135、270、540 g/株)研究其光合作用。结果表明:当施钾量为270 g/株时,各时期刺葡萄叶片的净光合速率均较高,着色期时达最大,为8.91μmol/(m^2·s);当施钾量为540 g/株时,各时期刺葡萄叶片的气孔导度均较高;当施钾量为270 g/株时,刺葡萄叶片的蒸腾速率在膨大期较高,为5.33mmol/(m^2·s);当施钾量为270 g/株时,除开花期之外,各时期刺葡萄叶片的胞间CO2浓度均处于较低水平;钾与净光合速率、蒸腾速率、气孔导度呈极显著正相关关系;在不同时期刺葡萄叶片的光合日变化均呈双峰曲线,在10:00和16:00时出现峰值,10:00时,膨大期、着色期和落叶期均以施钾量540 g/株时的净光合速率最大,分别为6.05、7.63和4.75μmol/(m^2·s),施钾量为270 g/株时的净光合速率次之,而开花期和成熟期分别以施钾量135、270 g/株时的净光合速率最大,分别为5.31和5.61μmol/(m^2·s);16:00时,除开花期以施钾量540 g/株时的净光合速率最大之外,其他时期均以施钾量270 g/株时净光合速率达最大值,分别为4.26、3.61、2.87、2.30μmol/(m^2·s)。综合本研究结果,施钾量为270 g/株时较有利于刺葡萄光合作用。