A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示:VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。

猪肠病毒G型部分VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究扩增猪肠病毒G型(EV-G)的部分VP1基因,将其克隆至原核表达载体,并对其进行诱导表达,获得重组蛋白并制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验对其进行验证。结果表明,本研究制备的兔抗EV-G-VP1多克隆抗体具有良好的免疫原性和反应性,可以特异性识别EV-G感染Marc-145细胞表达的VP1蛋白,为猪肠病毒G型免疫学检测方法的建立提供良好的生物学材料。

A型塞内卡病毒VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备A型塞内卡病毒(SVA)VP3蛋白多克隆抗体,采用同源重组技术将SVA VP3基因连接至原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-SVA-VP3。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),以1 mmol/L的IPTG进行诱导表达并纯化表达产物,随后将纯化的VP3重组蛋白皮下多点注射新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot分别对抗体效价、反应性和特异性进行鉴定。结果显示:重组VP3蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36 kDa;制备的VP3蛋白多克隆抗体能与VP3重组蛋白和SVA发生特异性反应,其ELISA效价达1:10000以上,Western blot和IFA效价达1:5000。综上,本研究成功制备了SVA VP3多克隆抗体,其具有较高的效价和特异性,可为后续SVA致病机制及检测方法等研究奠定基础。

猪细小病毒7型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)VP2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 VP2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

闭合复位交叉克氏针内固定治疗儿童桡骨远端Salter-Harris Ⅱ型骨折

目的 探讨闭合复位交叉克氏针内固定治疗儿童桡骨远端Salter-HarrisⅡ型骨折的疗效。方法 采用闭合复位交叉克氏针内固定治疗38例桡骨远端Salter-HarrisⅡ型骨折患儿。记录骨折复位及愈合情况、术后并发症发生情况、腕关节活动度。采用Gartland-Werley评分标准评价腕关节功能。结果 患儿均获得随访,时间3~6个月。骨折均解剖复位。骨折临床愈合时间4~6周,骨性愈合时间3~6个月。患儿均未发生骨折复位丢失、骨骺早闭及腕关节发育畸形等并发症,1例发生指伸肌损伤。末次随访时,腕关节活动度均恢复正常,其中掌屈50°~60°,背伸30°~60°,尺偏30°~40°,桡偏25°~30°;采用Gartland-Werley评分标准评价腕关节功能:优36例,良1例,可1例,优良率97.37%。结论 闭合复位交叉克氏针内固定治疗儿童桡骨远端Salter-HarrisⅡ型骨折,具有创伤小、骨折端固定稳定、患儿可早期功能锻炼、术后并发症少等优点。

关节克痹丸联合关节镜微创术治疗寒湿痹阻型膝骨关节炎临床研究

目的:观察关节克痹丸联合关节镜微创术治疗寒湿痹阻型膝骨关节炎的临床疗效。方法:选取2021年9月—2023年7月在南阳市中心医院骨科接受治疗的128例寒湿痹阻型膝骨关节炎患者作为研究对象,采用随机数字表法将患者分为观察组、对照组各64例。2组均给予关节镜微创术治疗,对照组术后给予甲氨蝶呤片治疗,观察组术后给予关节克痹丸治疗。比较2组临床疗效及治疗前后美国特种外科医院膝关节评分系统(HSS)、世界卫生组织生存质量测定量表简表(WHOQOL-BREF)、中医证候评分、微循环功能指标[血细胞平均运动速度(AVBC)、运动血细胞浓度(CMBC)、微血管血流灌注量(MBP)、经皮氧分压(Tcp O2)]、血清炎症因子[白细胞介素-6 (IL-6)、C-反应蛋白(CRP)]水平。结果:治疗后,观察组总有效率90.62%,对照组总有效率75.00%,2组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2组治疗后HSS、WHOQOL-BREF评分及AVBC、CMBC、MBP、Tcp O2均较治疗前升高(P<0.05),且观察组治疗后HSS、WHOQOL-BREF评分及微循环功能指标高于对照组(P<0.05)。2组治疗后中医证候评分及血清IL-6、CRP水平均较治疗前降低(P<0.05),且观察组治疗后中医证候评分及血清炎症因子水平均低于对照组(P<0.05)。结论:关节克痹丸联合关节镜微创术治疗寒湿痹阻型膝骨关节炎疗效确切,能够改善患者关节功能及微循环,减轻炎症反应。

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

云南省昆明地区2022年柯萨奇病毒A16型的VP1区分子特征

目的对昆明市某医院2022年从手足口病患儿分离的柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的全VP1基因区分子特征分析。方法对昆明市某医院2022年从手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)患儿200份临床样品粪便标本进行处理,分别通过RD细胞和Vero细胞分离,对经3次培养后仍产生细胞效应(cytopathogenic effect,CPE)的细胞培养液提取病毒核酸,然后用通用引物222/224经RT-PCR扩增并测序,序列经BLAST比对确定其血清型,对鉴定为柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的再用特异引物CA16VP1F/CA16VP1R扩增其全VP1区并测序和拼接。下载CVA16病毒标准序列,采用Geneious 5.4.1和MEGA 6.05等软件对本研究CVA16的全VP1区的核苷酸和氨基酸序列分析。结果经鉴定后共检出22株从Vero细胞分离CVA16和6株RD细胞分离的CVA16毒株,进一步通过特异引物扩增获得21株可用的CVA16VP1全长序列,基于全VP1基因系统进化分析,这21株CVA16全属于B1a基因型。21株CVA16全长VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为91.9%~99.6%和89.2%~99.3%;与中国CVA16 B1a基因型的其他株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.7%~96.3%和89.2%~97.0%。与CVA16 B1b其他参考株对比,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在84.3%~87.2%和89.2%~97.0%。与其它CVA16的B1a基因亚型相比较发现21个氨基酸位点出现变异。结论2022年中国云南省昆明某医院引起HFMD的CVA16毒株属于B1a基因型,应继续监测以明确其流行特征。

柯萨奇病毒A组10型VP1蛋白线性中和表位的筛选和鉴定

柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)是引起手足口病(HFMD)的常见病原体之一。应用重叠肽法筛选出覆盖CV-A10全长VP1区氨基酸序列的39条候选表位肽段,以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及微量中和抑制试验验证。结果发现,候选表位P6(CV-A10 VP1区第39~53位氨基酸)与CV-A10全病毒抗血清具有高反应性,且在3.91μg/mL的稀释质量浓度时仍具有中和抑制作用,为潜在中和表位。用P6肽免疫小鼠制备相应的抗血清,并以微量中和试验验证其保护能力,结果显示,P6抗血清的几何平均中和效价为1:8.97,可确定P6为CV-A10的中和表位。为了解P6序列在CV-A10型内的保守性,将P6的氨基酸序列与CV-A10各基因型代表株进行比对分析,结果显示,P6在CV-A10型内高度保守,表明P6为CV-A10的广谱性中和表位,可应用于CV-A10表位疫苗的研发。本研究旨在筛选鉴定CV-A10 VP1蛋白上的线性中和表位,为CV-A10表位疫苗的研发和HFMD的防控奠定基础。

五酯胶囊协同他克莫司治疗儿童激素耐药型肾病综合征的研究现状

激素耐药型肾病综合征(Steroid-resistant nephrotic syndrome, SRNS)治疗难度大、周期长、预后相对较差。他克莫司是儿童SRNS最常用的免疫抑制剂,但存在药代动力学个体差异大、治疗窗窄及需要定期监测血药浓度的缺点。五酯胶囊在早期临床中多联合用药以减少药物性肝损害的发生。但在随访过程中逐渐发现协同用药可以提高他克莫司的血药浓度,进而降低他克莫司的用药剂量,减轻他克莫司的不良反应。本文就五酯胶囊协同他克莫司治疗儿童SRNS的研究现状进行综述。

快速进展性散发型克–雅病一例并文献回顾

朊蛋白病(prion disease)是一类由具传染性的朊蛋白(prion protein, PrP)所致的中枢神经系统变性病。目前已知的人类朊蛋白病主要有克–雅病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、格斯特曼综合征(Gerstmann syndrome, GSS)、致死性家族性失眠症(fatal familial insomnia, FFI)、Kuru病。克–雅病(CJD)是最常见的人类朊蛋白病,发病呈全球性分布,发病率约为1/100万。CJD分为散发型、医源型(获得型)、遗传型和变异型四种类型。80%~90%的CJD呈散发型。克–雅病临床早期症状不典型,症状多且异质性大,给该病早期识别和诊断带来了很大困难。现报道1例快速进展的散发型克–雅病病例,总结其临床表现、影像学及相关检验结果、脑电图等,加强对散发型克–雅病的认识。

克氏综合征合并1型糖尿病及系统性红斑狼疮1例并文献复习

克莱恩费尔特综合征(Klinefelter syndrome,KS),简称克氏综合征,是男性最常见的性染色体异常疾病,也是男性原发性性腺功能减退症最常见病因,其特征为多生X染色体和高促性腺激素性性腺功能减退症,导致不同程度的精子发育障碍和不育症,可伴有糖尿病、肥胖、代谢综合征、骨质疏松、自身免疫性疾病等一系列共病。

兔出血症病毒2型SC株VP60蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得我国兔出血症病毒2型(RHDV2)SC株特异性单克隆抗体,研究以纯化RHDV2作为抗原免疫BALB/c小鼠,4次免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA方法筛选,获得一株能够稳定分泌RHDV2 VP60蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为6B3。经Western blot和间接免疫荧光试验验证,该单克隆抗体可识别RHDV2,不与RHDV1反应,具有良好的毒株特异性。亚型鉴定结果为IgG3,轻链为Kappa型,腹水ELISA效价为1∶80 000。本研究得到的针对RHDV2的特异性单抗,将对我国兔出血症的诊断及流行病学调查提供有效制剂。

内蒙古VP型垂直摆倾斜仪背景噪声特征分析

选取内蒙古地区5套VP型垂直摆倾斜仪2020-03~2021-02秒采样连续观测数据,计算加速度功率谱密度(PSD),对比分析不同台站、不同频率下VP型垂直摆背景噪声的时空变化特征。结果表明,VP型垂直摆背景噪声水平基本符合全球地震背景噪声模型频率特性;次微震频段背景噪声水平秋冬强、夏季最弱,季节性变化显著,未呈现出明显的空间分布特征;主微震频段背景噪声水平秋冬略大于春夏,春夏噪声水平相当,存在一定的季节性变化,不同台站背景噪声水平差异明显;在长周期频段,通常情况下四季噪声水平相近,无明显的季节性变化规律。若仪器受自然环境干扰,背景噪声水平也呈现秋冬高于春夏的季节性变化特征。此外,良好的洞体条件可有效降低长周期频段的背景噪声水平。

精原细胞瘤放化疗后继发C型尼曼匹克病1例报道并文献复习

目的报道1例在鞍区精原细胞瘤放化疗后出现C型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease type C,NPC)的病例,加强对尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease,NPD)的了解。方法对南部战区总医院内分泌科2021年6月收治的1例鞍区精原细胞瘤切除术、放化疗后逐渐出现垂体功能减退、重度肝损害、肝脾大,激素替代治疗后引起继发性糖尿病的青少年患者长达4年的病史进行回顾性分析。结果本例患者为青少年女性,鞍区精原细胞瘤切除术及放化疗后,逐渐出现不同程度血细胞下降、脂代谢异常、肝功能异常、肝脾增大等,行骨髓穿刺,形态学发现2%尼曼-匹克细胞,最终诊断为NPC。经输血、护肝、胰岛素降糖、激素替代等对症治疗后,各项指标较治疗前好转,精神较入院时稍好转,但患者仍存在黄疸、肝脾大,偶有精神异常。目前继续门诊随访,予对症治疗。结论对于颅内肿瘤术后或放化疗后所致内分泌与代谢相关症状,且同时伴有难以解释的神经、精神、脏器功能异常时,要考虑到NPC的可能性,可通过骨髓穿刺涂片发现尼曼-匹克细胞初步诊断。目前NPC的治疗以对症为主。

Ⅰ型牛疱疹病毒VP22蛋白原核表达及多克隆抗体制备

为制备Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)VP22蛋白抗体,选用国内分离株BHV-SHJS,在其UL49基因核酸序列第517至747位间设计引物扩增目的片段,构建pET-28a-UL49(172-249 aa)原核表达载体,转化载体至BL21(DE3)感受态细胞;经IPTG诱导表达并纯化VP22(172-249 aa)融合蛋白后;用该融合蛋白作抗原,以皮下注射的方式免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体;经间接ELISA、Western blot及间接免疫荧光(IFA)方法检测其灵敏度和特异性。结果表明,表达的VP22蛋白以包涵体形式存在;ELISA测定结果显示,制备的VP22蛋白抗体效价达到1∶16000;Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能与BHV-SHJS VP22特异性结合,具有良好的反应原性。试验结果为后期BHV-1感染宿主细胞在机制方面的研究和VP22功能的探究奠定了基础。

肠道病毒C组96型VP1蛋白线性B细胞表位筛选与鉴定

目的鉴定肠道病毒C组96型(enterovirus C96,EV-C96)VP1蛋白的线性B细胞表位。方法采用IEDB网站提供的在线分析工具分析、预测EV-C96 VP1蛋白的线性B细胞表位,结合其二级结构、β-转角、抗原性、亲水性等多项参数,筛选出优势候选表位;应用间接ELISA法检测候选表位与EV-C96免疫血清的反应性以及与21种其他常见手足口病病原血清的交叉反应性;应用微量中和试验测定表位抗体的中和效价;采用序列比对分析表位的序列保守性;应用结构对齐分析表位的结构特异性。结果通过生物信息学筛选出EVC96 VP1蛋白7个候选表位(P1~P7);ELISA法检测发现P7(氨基酸序列位置为282~304)与EV-C96多克隆抗体有强反应性,与其他常见EV多克隆抗体不发生明显反应;微量中和试验显示,P7抗体的中和效价低于1∶2;序列及结构分析结果显示,P7的氨基酸序列在EV-C96型内具有较高保守性,与其他EV相应位点氨基酸序列的结构有明显差异。结论P7表位为EV-C96特异的非中和性B细胞表位,可作为开发EV-C96检测试剂盒的候选抗原表位。

克氏针撬拨复位治疗复杂过伸型胫骨平台骨折体会

目的:探讨克氏针撬拨复位治疗伴后皮质损伤的复杂过伸型胫骨平台骨折的临床疗效。方法:选取2016年1月—2021年6月启东市中医院骨科收治的13例复杂过伸型胫骨平台骨折患者作为研究对象。患者骨折均累及双髁伴后方皮质断裂,均采用内外侧联合入路,克氏针撬拨复位,双钢板或三钢板固定,修复合并的软组织损伤,术后在限制性支具保护下进行功能锻炼,定期复查X线评估骨折愈合情况及复位情况,末次随访时采用Rasmussen放射学评分评估胫骨平台骨折复位情况,采用美国特种外科医院(HSS)评分评估膝关节功能。结果:13例患者均顺利完成手术,手术时间120~200 min,平均手术时间148 min;术中出血量250~400 mL,平均术中出血量300 m L。13例患者均获得完整随访,随访时间12~18个月,平均随访时间15.6个月。13例患者均获得骨性愈合,临床愈合时间8~18周,平均愈合时间14.3周。末次随访时无膝关节疼痛及膝关节不稳,膝关节活动度0°~135°。术后12个月,Rasmussen胫骨平台骨折放射学评分为14~18分,平均评分(15.32±0.51)分。术后12个月,HSS膝关节功能评分为83~97分,平均(92.38±1.32)分。结论:复杂过伸型胫骨平台骨折后倾角明显改变甚至前倾,克氏针撬拨复位技术应用简单,有利于平台后倾角的恢复。

补肾活血方联合克龄蒙治疗肾虚血瘀型卵巢储备功能下降的疗效观察

目的探讨补肾活血方联合克龄蒙治疗肾虚血瘀型卵巢储备功能下降(DOR)的疗效。方法选取2021年7月至2023年6月在我院诊治的120例肾虚血瘀型DOR患者,随机分为对照组和研究组各60例。对照组给予克龄蒙治疗,研究组在对照组基础上加用补肾活血方治疗。对比两组治疗效果,对比两组治疗前后中医证候积分、性激素水平、卵巢储备功能。结果研究组治疗总有效率(93.33%)显著高于对照组(80.00%)(P<0.05)。研究组治疗后的各项中医证候积分均低于对照组,性激素水平、卵巢储备功能均优于对照组(P<0.05)。结论在克龄蒙基础上加用补肾活血方治疗肾虚血瘀型DOR,可有效缓解患者症状,改善性激素水平及卵巢储备功能,临床疗效显著,值得推广应用。