基于分子生物学方法的食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7检测技术研究进展

对检测大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)的预富集技术和聚合酶链式反应(PCR)技术、等温扩增技术、基于成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白质系统(CRISPR/Cas)的技术等分子生物学方法进行论述,介绍了这些方法在E.coli O157∶H7检测中的研究进展,并对其检出限和靶基因等进行了比较,以期为E.coli O157∶H7的快速检测提供参考依据。

大肠杆菌O_（157）：H_7的生物学特性与实验诊断

大肠杆菌Ｏ_（１５７）：Ｈ_７的生物学特性与实验诊断吕厚东，李文华（微生物学教研室山西职工医学院）大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的研究，最初是在检测肠产毒性大肠杆茵产生的不耐热肠毒素（ＬＴ）时发现了一种不同于ＬＴ的可引起Ｖｅｒｏ细胞病变的毒素，当时称之为Ｖｅｒ...

口口相传“和(hùo)实生物”——试论口语戏曲生态优势

中国有近四百个口语戏种,从杂多民歌到单一声腔再到多腔拌和(huo)再到当下的戏歌,印证着花部(口语)戏曲“世之腔调三十年一变”的古训的相对正确。也是中国戏曲音乐衍展时不以人的意志为转移的自然规律,正如沧海桑田一般是绝不顾及人的好恶而渐行渐远,无法阻止也不能挽回。口语戏曲的蓬蓬勃勃、青春永葆,全赖于其口口相传而后“和(hùo)实生物”的生态优势。

焦化废水生物处理A/O/H/O工艺中氰化物的去除特性

针对焦化废水处理工程设计过程中极少涉及基于氰化物浓度变化与考察分析的实际问题,通过对已经运行的广东韶钢集团焦化废水处理工程统计数据的辨析,提出实现总氰化物高效去除的技术与运行强化方法。分析数据发现,在降解的过程中,氰化物滞后于酚类代表的有机物,络合氰的降解比游离氰慢,生物处理过程中由水力停留时间控制的碳源利用与金属离子的存在影响氰化物的降解,而A/O1/H/O2工艺在有效分配除碳过程与脱氮过程中实现了氰化物的高效降解。进一步工程实践证明,焦化废水处理全部指标达标的高效性可以通过充分考虑复杂组分降解动力学的协同与优化操作条件加以实现。

H_2O_2对生物法治理石油烃类污染物的影响

针对钻井泥浆中的石油烃类污染物,利用实验室分离筛选出的高效石油烃降解菌株,深入研究H2O2对石油烃生物降解的影响。研究表明:H2O2的适宜一次加入浓度为200 mg/L;菌株生长处于停滞期和对数期时,每8hr和2hr向含油泥浆中加入H2O2为最佳;加入H2O2的钻井泥浆中,石油类污染物的的降解率从38.1%提高到83.1%。H2O2的深度氧化和供氧的双重作用对泥浆中石油烃类污染物的生物降解起到明显促进作用。

肌红蛋白在Nafion/Fe_3O_4-CdTe/CdS量子点复合膜内的直接电化学及其应用于H_2O_2的生物传感

利用磁性纳米Fe3O4和CdTe/CdS量子点结合Nafion的良好成膜性,将肌红蛋白(Mb)固定在玻碳电极表面制备成Nafion/Fe3O4-CdTe/CdS-Mb/GCE修饰电极。在pH 7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,固定在膜内的Mb表现出良好的直接电化学性质,在-0.351 V处有1对近乎可逆的氧化还原峰,为Mb中血红素辅基Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)电对的特征氧化还原峰,并显示了很好的稳定性。表明Nafion/Fe3O4-CdTe/CdS复合膜的微环境有利于Mb中Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)与电极之间的直接电子传递和Mb的固定。同时,探讨了该修饰电极表面固定的Mb对H2O2的催化还原,结果显示,该修饰电极可作为H2O2生物传感器,实现对H2O2的快速(响应时间小于5 s)、准确检测,灵敏度可达30.6 mA.L/mol,检出限(S/N=3)为0.89μmol/L。

牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及其生物学特性研究

目的为了解郑州地区牛携带大肠杆菌O157∶H7的情况。方法应用本实验室已建立的大肠杆菌O157∶H7多重PCR方法对其进行了检测,并对临床分离的动物源大肠杆菌O157∶H7的生物学特性及携带的毒力基因情况进行了分析。结果所采集的样品中共分离鉴定出2株大肠杆菌O157∶H7,分别命名为L1和L2,其检出率为1.4%;临床分离菌株的生化试验结果均符合大肠杆菌的常规生化特性;L1和L2菌株的生长曲线一致,均比标准株的迟缓期短,较早进入对数生长期;L1菌株在48h可形成成熟完整的生物被膜,L2菌株在36h形成成熟完整的生物被膜;L1和L2菌株均携带有hlyA和eaeA毒力基因,同时L1还携带Stx2毒力基因。结论该结果为大肠杆菌O157∶H7流行病学调查提供了相关数据,对郑州地区大肠杆菌O157∶H7有效的监测奠定了基础。

生物传感器检测食源性大肠杆菌O157:H7研究新进展

近年来,生物传感器因具有快速、简便、灵敏度高、低成本等优势被广泛应用到临床检测、环境监测等领域。该技术在食品安全领域也逐步得到重视,尤其在病原微生物的快速检测方面。本文从免疫识别和核酸识别两方面简要介绍生物传感器技术检测食源性大肠杆菌O157:H7研究的最新进展,对生物传感器技术存在的问题及未来的研究方向进行了总结及展望。

急性运动诱导大鼠骨骼肌线粒体生物合成：H2O2参与介导PGC-1α转录

目的:线粒体产生的活性氧(ROS)是多种重要细胞信号转导通路的调节中心,本文拟探讨运动源性的过氧化氢(H2O2)是否作为信号分子参与了运动诱导的骨骼肌线粒体生物合成过程。方法:以大鼠急性递增负荷跑台运动为模型,连续观察和分别测定对照组(C),运动中45min、90min1、20min 150min(分别以E45、E90、E120和E150组表示)及运动后恢复3h、6h、12h、18h和24h(分别以R3h、R6h、R12h、R18h和R24h组表示)各时间点骨骼肌组织中H2O2浓度,PGC-1α、NRF-1、Tfam、COX IV mRNA表达,PGC-1α、Tfam、COX IV和p38MAPK蛋白含量以及p38MAPK活性的变化。结果:1)与对照组比较,E45组骨骼肌H2O2浓度即开始呈现显著性增加,并持续到R6h组(均P<0.001);在R12h组出现短暂降低后,又持续显著性增加至R24h组(均P<0.001);2)E150和R3h组PGC-1αmRNA表达与对照组相比显著增加(P<0.01和P<0.001);随后,R6h^R18h组PGC-1αmRNA表达降低(P>0.05),R24h组PGC-1α基因表达又呈现显著性增加(P<0.05)。PGC-1α蛋白含量滞后于其基因表达,在R6h和R12h组中显著增加(均P<0.001);3)R3h^R12h组骨骼肌NRF-1mRNA表达较对照组显著增加(P<0.01和P<0.001)。随后,NRF-1基因转录开始下降(P>0.05);4)除E150组外,从E90~R24h组的骨骼肌Tfam mRNA均较对照组显著增加(P<0.01和P<0.001)。E45和E90组的Tfam蛋白含量较对照组呈现短暂的显著增加(P<0.001),在E120组降低后又呈现显著性增加,直至R24h组(均P<0.001);5)E120组骨骼肌COX IV基因表达较对照组显著增加(P<0.05),恢复期R3h^R18h组呈显著性增加(均P<0.001)。运动中各组COX IV蛋白含量较对照组未呈现显著增加,但恢复期各时间段COX IV蛋白水平均呈显著性增加(均P<0.001);6)骨骼肌p38 MAPK活性(磷酸化p38 MAPK)在E90~R6h组,R18h^R24h组呈显著性增加(分别P<0.05、P<0.01和P<0.001)。仅R3h组p38 MAPK蛋白含量较对照组呈显著性增加(P<0.05)。结论:一次急性运动即可影响COX IV基因和蛋白表达,诱导骨骼肌线粒体生物合成;运动源性的H2O2可能通过先行激活p38MAPK磷酸化和继发诱导p38MAPK信号通路两个途径影响PGC-1α基因转录和线粒体生物合成的下游信号级联反应。

F_0F_1-ATPase生物传感器检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7

目的研究F0F1-ATPase纳米生物传感器在肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测中的应用,开发高灵敏、特异性强的快速检测技术。方法利用免疫技术构建信号识别元件,根据F0F1-ATPase酶学机制建信号转化系统,建立免疫生物传感器,最后通过荧光扫描仪进行信号检测。本研究以食品中常见的大肠埃希菌(Escherichiacoli)和沙门菌(Salmonellatyphi)为干扰菌株进行了该方法的特异性研究。结果检测时间为4.5h,102～104cfu呈现良好的梯度性和线性,R2=0.9818。空白对照组和102cfu/孔均与104cfu/孔组存在极显著性差异,P值分均为P=0.00<0.01。结论 F0F1-ATPase纳米生物传感器对O157:H7检测快速、灵敏、特异性好,有良好的应用前景。

快速检测大肠杆菌O157:H7的电化学阻抗免疫生物传感器

建立了一种采用电化学阻抗谱技术快速检测大肠杆菌O157∶H7的生物传感器,它是通过石英晶体金电极表面附着一层蛋白A膜来固定抗体的。该生物传感器采用了三电极系统-工作电极石英晶体金电极、Ag/AgCl/Cl-SAT参考电极和铂对电极。和以往的普通金电极不同,第一次采用了石英晶体金电极。试验结果说明抗体的固定以及大肠杆菌O157∶H7与抗体的结合都增加了石英晶体金电极表面的电子传递阻抗,在[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原对存在的情况下,用电化学阻抗谱测量该阻抗。该免疫生物传感器的检测限是103cfu/mL,石英晶体金电极的电子传递阻抗变化值和大肠杆菌O157∶H7的浓度在一定范围内呈线性关系,检测时间少于10 min。

基于自组装L-半胱氨酸与纳米金的H_2O_2生物传感器

通过在金电极表面自组装L-半胱氨酸，再分别吸附纳米金与辣根过氧化物酶（HRP）的方法，成功的制备了H2O2生物传感器。采用循环伏安法考察了传感器的电化学特性，电极对H202在浓度为2．1×10^-6～3．6×10^-3mol／L的范围内呈线性，检出限为8．9×10^-7mol／L（S／N=3）。该传感器具有稳定性好，线性范围宽，检出限低等优点，同时具有一定的抗干扰能力。

利用光纤倏逝波生物传感器检测食品中大肠杆菌O157:H7

目的建立一种应用光纤倏逝波生物传感器快速检测食品中大肠杆菌O157:H7的方法。方法对光纤用大肠杆菌O157:H7抗体包被制备检测探针,用纳米量子点对抗体进行偶联制备检测抗体,并确定其检测的灵敏度和特异性,同时通过对人工污染样品的检测确认该方法检测实际样本的可行性。结果建立的光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度达到50 CFU/mL,并具有较强的特异性。结论利用光纤倏逝波生物传感器检测食品中污染的大肠杆菌O157:H7方法快速、准确,具有较强应用价值。

溶胶凝胶壳聚糖/二氧化硅杂化复合膜固定辣根过氧化酶的H_2O_2电化学生物传感器的研制

利用溶胶 凝胶法制备壳聚糖 二氧化硅有机无机复合杂化膜,用于对辣根过氧化酶进行固定,制得测定H2O2的电流型生物传感器。以1mmol/LK4Fe(CN)6作为电子媒介体。研究了各种因素如壳聚糖与二氧化硅的比率、pH、温度、工作电位等对传感器响应电流的影响。计时电流法测定H2O2的线性范围为2.0×10-6～6.8×10-4mol/L,检出限为8.0×10-7mol/L。测得酶催化动力学参数米氏常数Km=0 87mmol/L。用该法对实际样品进行了测定。

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E．coli O157：H7（EHEC—O157：H7）用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB／c小鼠，制备免疫脾细胞；与SP2／0骨髓瘤细胞融合后，获得7株分泌抗E．coli O157：H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚类分别是IgG2ak、IgG2aK、IgG1K、IgMK、IgMh、IgMK和IgG2aK。用间接ELISA检测，E7和F1细胞培养上清液的效价为1．6×10^3，腹水效价均为1×10^11；C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×10^2，腹水效价均为1×10^3。相加ELISA结果显示，F1、G9和G113株mAbs对应相同的抗原表位，而其它4株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Westernblotting表明，c3、E7和F13株mAbs在蛋白分子量28×10^3处有特异性条带，而其它4株mAbs则未显示蛋白带。

肉桂精油对蔬菜表面大肠杆菌O157∶H7生物膜的杀菌作用研究

实验评价了肉桂精油对大肠杆菌O157:H7的杀菌活性,并且研究了肉桂精油对新鲜蔬菜表面大肠杆菌O157:H7生物膜的清除效果。实验结果表明,肉桂精油具有较强的杀菌活性,短时间内即可灭活高浓度的大肠杆菌O157:H7游离细菌。此外,肉桂精油对大肠杆菌O157:H7生物膜有较好的清除作用,其最小抑制生物膜浓度(MBIC)和最小清除生物膜浓度(MBEC)仅为0.5 mg/m L和1 mg/m L,在浓度为2 mg/m L及4 mg/m L时,可在60 min内完全灭活生物膜细菌。当肉桂精油应用于生菜、菠菜、莴苣、青椒及黄瓜表面时,大肠杆菌O157:H7生物膜细菌数量大幅降低。附着在蔬菜表面的生物膜经4 mg/m L精油处理2d后,细菌数量均低于10 CFU/cm2。

一株与EHECO_(157):H_7诊断血清交叉凝集的维罗纳气单胞菌温和生物变种的分离鉴定

目的对检出引起腹泻的新病原菌进行分离鉴定,为腹泻病原学理论及腹泻病因的防治提供依据。方法采取在SMAC上分离获纯培养菌、血清学检验、药敏试验和电子显微镜观察形态,以及微生物鉴定仪进行系统生化鉴定的方法。结果检出1株氧化酶阳性且能与EHECO157:H7诊断血清发生强凝集反应的维罗纳气单胞菌温和生物变种。结论该菌株的发现提示在分离EHECO157:H7时,为避免出现假阳性,必须进行系统化鉴定,以确保菌株鉴定的准确性。

肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺毒素ⅡA1亚单位单克隆抗体的制备和生物学特性鉴定

目的制备出高效价的抗志贺毒素ⅡA1亚单位(STX2A1)的单克隆抗体。方法以重组GST-STX2A1融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用细胞杂交瘤技术制备,以天然STX2毒素为筛选抗原,采用间接ELISA法筛选产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株;以体内诱生法产生腹水,并采用Protein A-Sepharose柱对其纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚类,采用间接ELISA相加实验鉴定抗原识别表位。结果获得3株产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株STX2-1A3、STX2-1E10、STX2-3A7,Ig亚类分别为IgG1λ型、IgG1κ型和IgG3κ,亲和力常数分别为5.76×109、1.21×109和3.97×108。结论成功制备3株稳定分泌抗STX2A1的杂交瘤细胞株,产生的单克隆抗体特异性好,亲和力高,能与天然STX2A亚单位反应。