贵州苗药方“四大血”对CIA大鼠滑膜血管增生的作用机制

目的研究贵州苗药方“四大血”(SX)对胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)大鼠滑膜血管增生的作用机制。方法42只SD大鼠随机分成“四大血”高、中、低剂量组(SX 40g/kg组、SX 20g/kg组、SX 10g/kg组),雷公藤多苷片对照组(GTW)、空白对照组(Nor)、模型组(Mod),每组7只。构建牛Ⅱ型CIA大鼠模型。测量大鼠后肢足跖的肿胀程度并进行关节炎指数(AI)评分,蛋白免疫印记法检测滑膜组织中人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)、磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)的表达,实时荧光定量法检测大鼠滑膜组织中血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测大鼠血清VEGF的表达水平。结果 GTW组及SX各治疗组关节炎指数(AI)评分和足肿度都小于Mod组(P<0.01)。在光镜下观察大鼠足趾病理组织切片,Mod组可见大量炎性细胞浸润,各层组织结构混乱。与Mod组相比,SX组和GTW组炎性细胞浸润明显下降,纤维组织增生水肿减轻,炎性细胞数减少(P<0.01);血清中VEGF含量降低(P<0.01);GTW和SX40g/kg、10g/kg剂量组滑膜组织中VEGF、VEGFR-2mRNA的表达水平均降低(P<0.05,P<0.01);GTW组、SX组关节滑膜组织中PTEN的表达上升(P<0.05,P<0.01);SX组和GTW组AKT、PI3K蛋白表达下调(P<0.01)。结论 SX能上调负调控蛋白PTEN,进而减缓PI3K/AKT通路的活化程度,下调VEGF、VEGFR-2的表达。本研究为RA的治疗提供了新靶点。

苗药验方“四大血”对胶原诱导关节炎大鼠IL-17和VEGF表达的影响

目的:探讨苗药验方“四大血”(SX)对牛Ⅱ型胶原蛋白诱导关节炎(CIA)大鼠白细胞介素17(IL-17)及血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的影响。方法:42只SD大鼠分为空白对照组(NG组,n=7)及造模组(n=35),除NG组外,所有大鼠用牛Ⅱ型胶原与等量不完全弗氏佐剂混合乳化剂于尾根部皮下注射致炎、复制CIA动物模型,造模第14天将造模组大鼠均分为模型对照组(Mod组),SX高、中、低药物治疗组(分别给予SX40、20及10g/kg灌胃,21d,n=7)及阳性药物对照组(GTW组,给予雷公藤多甙片40g/kg灌胃,21d,n=7);于造模第14天、给药治疗第7、14及21天时检测足肿胀度(ER);给药第21天时,观察大鼠膝关节滑膜组织病理改变,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定大鼠膝关节滑膜组织VEGFmRNA的表达,ELISA法检测测大鼠血清IL-17及VEGF水平。结果:与Mod组相比,SX40、20及10g/kg组、GTW组大鼠足关节ER减轻,关节滑膜组织炎性细胞浸润明显下降,纤维组织增生及水肿程度减轻;治疗第21天时,与Mod组比较,SX40、20及10g/kg组大鼠膝关节滑膜组织VEGFmRNA水平、血清VEGF含量均显著降低(P<0.01),SX40、20g/kg组血清IL-17含量显著降低(P<0.01)。结论:SX能有效缓解CIA病情,其机制可能与降低IL-17和VEGF含量有关。

苗药方“四大血”形性特征与适应症范围

本文通过对苗药方四大血中血藤、血飞、舒筋、活血四药的外形、内质、性味、功能、主治病证的分析,指出四大血最常用品种的植物学科属,并得出结论:四大血最主要的适应症为风湿疼痛、跌打损伤、血瘀、月经不调、瘫痪;其次为肢体麻木;再次为胃痛、血虚经少、经闭。四大血合方寒热平调,治症广泛,是苗医通气散血治疗原则的代表性方剂。

苗药四大血减轻大鼠的类风湿性关节炎:基于下调基质金属蛋白表达

目的探究贵州苗医验方“四大血”(SX)对胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠关节骨、软骨破坏及滑膜血管新生的作用机制。方法将42只SD大鼠均分为空白组(Nor)、模型组(Mod)、雷公藤多苷片阳性对照组(GTW,40 g/kg)和SX高、中、低剂量组(SX40、20、10g/kg),7只/组。通过皮下注射牛型II胶原来建立CIA大鼠模型,并且通过每天经口灌胃的方式给予治疗,持续3周。采用AI评分分别于造模前,灌胃前1周,灌胃后1周,灌胃2周,灌胃3周观察大鼠后足关节病变情况。HE染色法观察大鼠关节滑膜病理变化,ELISA法检测TNF-α、IL-1β,Real-timePCR检测滑膜组织中NF-κBp65、MMP1、MMP2、MMP9mRNA表达水平,Westernblot检测滑膜组织中NF-κBp65、基质金属蛋白1(MMP1)、MMP2、MMP9蛋白表达水平。网络药理学获取SX外用途径治疗类风湿性关节炎(RA)中的重要靶蛋白,经拓扑分析后筛选出核心靶蛋白。结果GTW组和SX高、中、低剂量组足跖肿胀度及关节炎指数评分均小于Mod组(P<0.05)。光镜下观察大鼠关节滑膜病理组织切片,Mod组可见较多软骨细胞坏死,软骨下层骨组织受侵蚀,并有新生毛细血管形成;而GTW组和SX高、中、低剂量组中,软骨及骨损伤均有不同程度地降低,新生血管数量减少,随SX剂量增高,治疗效果呈逐渐增强的趋势。与Mod组相比,GTW组和SX高、中、低剂量组滑膜组织TNF-α、IL-1β、NF-κBp65、MMP1、MMP2、MMP9mRNA和蛋白表达量有不同程度地降低(P<0.05)。经网络药理学分析得到外用SX治疗RA中的核心靶蛋白—MMPs。结论SX可以改善CIA大鼠关节骨和软骨的破坏、减缓滑膜血管新生,其机制可能为调节MMP基因表达的TNF-α/IL-1β/NF-κB-MMP1、2、9信号转导途径,下调MMPs表达水平,此外可初步推断MMPs在除口服治疗途径以外仍发挥关键作用。

苗药验方四大血可减少关节炎大鼠滑膜组织的坏死性凋亡和血管新生:基于抑制RIPK1/RIPK3/MLKL通路

目的探究贵州苗医验方“四大血”(SX)对胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠滑膜组织坏死性凋亡和滑膜血管新生的作用机制。方法将42只SD大鼠均分为空白组(Nor)、模型组(Mod)、雷公藤多苷片阳性对照组(GTW,40 g/kg)和SX高、中、低剂量组(SX 40 g/kg、SX 20 g/kg、SX 10 g/kg),7只/组。构建CIA大鼠模型。建模后测量大鼠双后肢足跖肿胀程度并进行关节炎指数评分。ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β和IL-17变化,HE染色法观察大鼠关节滑膜病理变化,Real-time PCR检测滑膜组织中VEGF、MMP-9、Ang-1、RIPK1、RIPK3、Caspase-8 m RNA表达水平,Western blot检测滑膜组织中VEGF、MMP9、Ang-1、STAT-3、RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL、Caspase-8蛋白表达水平。结果GTW组和SX高、中、低剂量组足跖肿胀度及关节炎指数评分均小于Mod组(P<0.05)。在光镜下观察大鼠关节滑膜病理组织切片,Mod组可见大量炎性细胞浸润,各层组织结构混乱;而药物治疗组中,炎性细胞浸润、滑膜血管新生和滑膜增生程度均降低。且随SX剂量增高,治疗效果呈逐渐增强的趋势。与Mod组相比,GTW组和SX 40 g/kg组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-17含量,滑膜组织中RIPK1、RIPK3、VEGF、Ang-1、MMP9 mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05),Caspase-8 mRNA和蛋白表达水平增高(P<0.05)并下调Stat-3蛋白表达和MLKL的磷酸化水平(P<0.05)。结论SX可以改善CIA大鼠滑膜血管新生,其机制可能与抑制RIP1/RIP3/MLKL信号通路激活,并下调促血管生长因子VEGF、Ang-1、MMP9、STAT-3表达有关。

基于网络药理学探究苗药“四大血”对类风湿性关节炎自噬的影响

本研究皆在探究苗药“四大血”(Sidaxue,SX)调控类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)中细胞自噬的分子机制。首先,构建胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,SX给药21 d后计算大鼠胸腺指数和脾脏指数,观察大鼠膝关节滑膜组织病理改变,并检测大鼠血清白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-37(interleukin-37,IL-37)水平。进一步利用网络药理学分析SX调控RA中细胞自噬的可能分子机制,并借助Autodock vina软件进行分子对接验证,同时通过在线数据库预测SX主要活性成分的药学性质,结合分子对接评分初筛效应成分。最后,利用RT-qPCR和Western blot分别检测SX对CIA大鼠滑膜组织中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)及微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)mRNA和蛋白表达的影响。动物实验结果表明,SX能有效缓解CIA大鼠关节肿胀,缓解免疫器官的过度反应,改善滑膜组织病理改变,降低炎症因子IL-6、IL-37水平(P<0.05)。网络药理学结果表明,AKT1、CASP3、BCL2L1等靶点较为关键,动物自噬、凋亡及PI3K/AKT信号通路等途径与RA相关且显著性较高,分子对接结果显示PI3K/AKT信号通路关键靶点与SX主要活性成分稳定结合,β-谷甾醇、卡亚宁、乌索酸和胡萝卜苷可能是SX调控自噬的较优效应成分。RT-qPCR和Western blot实验结果显示,SX呈剂量依赖性下调PI3K、AKT、mTOR mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.001)的表达,上调自噬标志物LC3 mRNA表达水平(P<0.05),促进LC3-Ⅰ转变为LC3-Ⅱ(P<0.01)。综上所述,SX具有改善RA的作用,其机制可能是抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,进而促进滑膜细胞发生自噬性细胞死亡以拮抗滑膜细胞的异常增殖。

苗药四大血对佐剂性关节炎大鼠抗炎作用研究

目的研究苗药"四大血"对佐剂性关节炎大鼠的抗炎作用,并探讨其作用机制。方法 60只大鼠随机分成空白组、模型对照组、"四大血"高、中、低剂量组和阳性对照组,每组10只。除空白组外,其余各组采用足趾部皮下注射弗氏完全佐剂,建立佐剂性关节炎大鼠(AA)动物模型。观察各组大鼠右足跖外观变化、肿胀程度、滑膜组织病理特征;Elisa法检测大鼠膝关节滑膜组织炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平。结果给药后,"四大血"中、高剂量组及阳性对照组足跖肿胀程度明显小于模型对照组(P<0.05);病理切片显示,"四大血"中、高剂量组较模型对照组大鼠滑膜组织充血减轻,炎性细胞浸润减少。酶联免疫吸附试验(Elisa)检测显示与模型对照组比较,"四大血"能下调IL-1β和TNF-α的表达量(P<0.05,P<0.01)。结论 "四大血"有抑制AA大鼠滑膜组织炎症的作用,减少滑膜组织炎性细胞浸润及滑膜上皮细胞增生,其作用机制可能与下调炎症介质IL-1β、TNF-α的表达有关。