中英HEL项目暨国内“微孢子与微孢子虫病”专题研讨会在华南农业大学召开

为进一步加深国内外同行的合作与交流,2004年3月10日至13日在华南农业大学召开了'中英HEL项目暨国内微孢子虫与微孢子虫病'专题研讨会.

东方蜜蜂微孢子虫腺苷酸激酶的生物信息学与基因表达特征

本研究旨在解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的腺苷酸激酶(Adenylat kinase,ADK)NcADK的理化性质和分子特性,并检测NcADK基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中的表达特征,以期丰富NcADK相关信息,并为进一步的功能研究提供依据。利用相关生物信息学软件预测和分析NcADK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件和Batch CD-Search工具分别预测东方蜜蜂微孢子虫和其它7种微孢子ADK蛋白的保守基序和保守结构域。通过Mega 11.0软件基于ADK氨基酸序列构建进化树。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中NcADK的相对表达量。结果表明,NcADK的CDS含有540个核苷酸,可编码179个氨基酸;NcADK的分子量约为20.66 kDa,分子式为C903H1488N258O278S8,脂肪系数为100.61,平均亲水系数为-0.502,等电点为6.83,含29个负电荷氨基酸和29个正电荷氨基酸;NcADK可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核、囊泡和过氧化物酶体;NcADK含20个磷酸化位点,不含典型的信号肽;NcADK含88个α-螺旋,24条延长链,17个β-转角,50个无规则卷曲,与模板A0A0F9WEU7.1.A之间的序列同源性为100%;在东方蜜蜂微孢子虫、东方赤孢子虫Hamiltosporidium tvaerminnensis、肠脑炎微孢子虫Encephalitozoon intestinalis、按蚊微孢子虫Anncaliia algerae和角膜条孢虫Vittaforma corneae ADK中均鉴定到1个相同的结构域和5个相同的保守基序;东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫Nosema apis的ADK在进化树上聚为一支。相较于接种后1 d(1 day post inoculation,1 dpi),NcADK的表达量在2 dpi上调但无显著差异(P>0.05),在3 dpi和4 dpi均显著上调(P>0.05)。研究结果明确了NcADK的理化性质和分子特性,并揭示NcADK是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,不同微孢子虫的ADK具有较强的保守性,东方蜜蜂微孢子虫及其姐妹种蜜蜂微孢子虫的ADK具有高同源性,NcADK在3 dpi和4 dpi被激活表达。

云南蚕区家蚕微孢子虫遗传多样性分析

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是蚕业生产上一种重要病害——微粒子病的病原体。探讨家蚕微孢子虫种内的遗传多样性,可为云南蚕区家蚕微粒子病的防控提供参考依据。从云南省不同养蚕地区收集了感染微孢子虫的病蚕样品,分离纯化家蚕微孢子虫并提取基因组,克隆SSU rDNA(small subunit ribosomal DNA)和ITS(internal transcribed spacer)序列并进行生物信息学分析。结果发现,云南蚕区Nosema bombycis分离株SSU rDNA序列同源性高达99%以上,遗传距离小于0.006,它们在长度和多个位点存在差异,呈现不同程度的多态性;ITS遗传差异较为显著,序列中存在多碱基的插入或缺失、单碱基的转换和颠换。基于SSU rDNA和rDNA-ITS序列构建系统发生树,结果显示,云南蚕区家蚕微孢子虫分离株系间存在遗传分化,种群间亲缘关系与地理位置无直接联系。研究结果丰富了云南蚕区家蚕微孢子虫的种内遗传多样性。

东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-11248及其靶基因SGT1的生物信息学和表达谱研究

【目的】对前期鉴定所获得的东方蜜蜂微孢子虫的nce-miR-11248进行表达和序列验证,预测、分析其靶基因,并检测nce-miR-11248及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达谱,为进一步开展nce-miR-11248调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能及作用机制研究提供参考。【方法】利用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-11248的真实性;利用相关生物信息学软件预测nce-miR-11248的靶基因,并分析其编码蛋白的分子特性;使用MEME和TBtools软件预测SGT1蛋白的保守基序和结构域,通过Mega 11.0软件进行氨基酸序列多重比对,采用邻接法构建系统进化树。采集东方蜜蜂微孢子虫孢子侵染1,2,4,6和8 d的意蜂工蜂中肠组织,采用RT-qPCR检测nce-miR-11248及其靶基因SGT1的表达谱。【结果】nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在,其序列长度为25 bp。nce-miR-11248的靶基因为SGT1。SGT1蛋白分子式为C_(765)H_(1213)N_(195)O_(241)S_(4),分子质量约为17.10 ku,脂溶系数为82.67,等电点为5.50,亲水系数为-0.709,不含典型的信号肽和跨膜结构域,可同时定位于细胞核、线粒体和过氧化物酶体。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、泛胞虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1中均含有4个保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4)和1个结构域(SGT1超家族结构域)。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1聚为一支,且东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1进化距离最近。相较于侵染东方蜜蜂微孢子虫后1 d,侵染后2,4,6和8 d nce-miR-11248的表达量均显著下调(P<0.05);侵染后2,4,6和8 d SGT1的表达量均下调,其中侵染后4,6和8 d的表达量与2 d的差异达显著水平(P<0.05)。【结论】nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在;东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1亲缘关系最近;随着侵染时间的延长,nce-miR-11248及其靶基因SGT1在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达量均呈持续下降;nce-miR-11248和SGT1是潜在的参与调控微孢子虫侵染过程的因子。

东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-15338及候选靶基因的表达谱

【目的】本研究旨在为探究nce-miR-15338调控东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂的功能及作用机制提供参考和依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-15338的存在和表达。利用相关软件预测nce-miR-15338的靶基因并进行数据库注释。通过RT-qPCR检测nce-miR-15338及其候选靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中的表达谱。【结果】nce-miR-15338在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达;nce-miR-15338共靶向LCFAL 2和20s PS等16个基因;分别有16、7、8、3个靶基因可注释到Nr、Swiss-Prot、GO和KEGG数据库;相较于接种后1 d,nce-miR-15338的表达量在2 d极显著上调,在4、6、8 d均极显著下调;LCFAL 2的表达量在接种2、4、6、8 d后皆为极显著下调;20s PS在接种2、4、6、8 d的表达水平均为极显著下调。【结论】研究结果证实了nce-miR-15338的真实存在和表达,并明确了东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-15338及其候选靶基因LCFAL 2和20s PS的表达规律。

东方蜜蜂微孢子虫RRDRP的分子特性及系统进化分析

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的Rad18-like重组与DNA修复蛋白(Rad18-like recombination and DNA repair protein,RRDRP)进行系统进化分析,为进一步研究其功能提供理论依据。【方法】利用Protparam、ProtScale和SWISS-model等软件分析RRDRP的理化性质、亲水性和三级结构。利用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等软件预测RRDRP的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构。使用PSORTⅡ软件预测RRDRP蛋白的亚细胞定位。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种RRDRP的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RRDRP进行氨基酸序列多重比对,并采用邻接法构建系统进化树。【结果】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP基因含有2928个核苷酸,可编码975个氨基酸,分子质量约11.50 ku,脂溶系数93.58,等电点6.63,分子式C_(5135)H_(8253)N_(1377)O_(1545)S_(34),平均亲水系数为-0.627,可同时定位于细胞核、细胞质、过氧化物酶体和细胞骨架;RRDRP包含55个磷酸化位点、678个α-螺旋、99条延长链、22个β-转角及176个无规则卷曲;RRDRP不含信号肽与跨膜结构域。东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、颗粒病微粒子虫等11个物种的RRDRP中均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)。东方蜜蜂微孢子虫与颗粒病微粒子虫在进化树上聚为一支,同源性较高。【结论】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,在东方蜜蜂微孢子虫以及其他微孢子虫和真菌中高度保守。【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的Rad18-like重组与DNA修复蛋白(Rad18-like recombination and DNA repair protein, RRDRP)进行系统进化分析,为进一步研究其功能提供理论依据。【方法】利用Protparam、ProtScale和SWISS-model等软件分析RRDRP的理化性质、亲水性和三级结构。利用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等软件预测RRDRP的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构。使用PSORT Ⅱ软件预测RRDRP蛋白的亚细胞定位。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种RRDRP的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RRDRP进行氨基酸序列多重比对,并采用邻接法构建系统进化树。【结果】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP基因含有2 928个核苷酸,可编码975个氨基酸,分子质量约11.50 ku,脂溶系数93.58,等电点6.63,分子式C5135H8253N1377O1545S34,平均亲水系数为-0.627,可同时定位于细胞核、细胞质、过氧化物酶体和细胞骨架;RRDRP包含55个磷酸化位点、678个α-螺旋、99条延长链、22个β-转角及176个无规则卷曲;RRDRP不含信号肽与跨膜结构域。东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、颗粒病微粒子虫等11个物种的RRDRP中均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)。东方蜜蜂微孢子虫与颗粒病微粒子虫在进化树上聚为一支,同源性较高。【结论】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,在东方蜜蜂微孢子虫以及其他微孢子虫和真菌中高度保守。

家蚕响应微孢子虫感染的可变剪接事件分析

【目的】家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)感染引发的微粒子病是影响蚕业发展的重要病害。为了揭示可变剪接(AS)基因在家蚕响应微孢子虫感染中的作用,对其中肠内的AS事件进行分析。【方法】利用Illumina Hiseq TM 4000测序平台,对健康家蚕(对照组)和被微孢子虫感染的家蚕中肠组织进行转录组测序。使用rMATS软件对样品中的AS事件与差异剪接基因(DSGs)进行鉴定,并对DSGs进行GO富集和KEGG信号通路分析。【结果】在对照组和感染组中分别检测到5346个和4992个AS事件,两组的AS事件类型都以外显子跳跃(SE)事件为主,差异分析发现了25个显著的DSGs。GO富集分析表明,DSGs主要富集在21个条目,其中以细胞过程、物质代谢、结合、催化活性的基因数量较多;KEGG信号通路分析显示,DSGs富集数较多的是信号传导、免疫系统、多糖生物合成与降解、能量代谢等通路。【结论】家蚕中肠组织存在大量AS事件,在微孢子虫感染过程中存在25个DSGs,其功能涉及新陈代谢和细胞免疫等。

东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-26675及其靶基因NcSec24的研究

【目的】探明nce-miR-26675通过靶向调控蛋白转运体NcSec24基因的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程,为其侵染意大利蜜蜂工蜂的机制提供依据。【方法】联用RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-26675的靶基因,取交集作为靶基因集合。使用Blast工具将靶基因比对到基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库以获得相应的功能和通路注释。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-26675和NcSec24的表达谱。利用Expasy网站上的相关软件预测和分析NcSec24的理化性质和分子特性。分别使用MEME和TBtools软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种NcSec24蛋白的保守基序和结构域。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的NcSec24蛋白进行氨基酸序列多重比对,并采用邻接法构建了基于NcSec24蛋白的系统进化树。【结果】nce-miR-26675靶向NcSec24等13个基因,其中,10个靶基因可注释到GO中的37个功能条目,6个基因注释KEGG中的23条KEGG通路。与接种后1 d相比,nce-miR-26675的表达量在接种后2 d显著上调(P<0.05),在接种后3、4 d显著下调(P<0.05),呈现先上升再下降的趋势;NcSec24的表达量在接种后2、3、4 d均显著下调(P<0.05),表现出持续下降的趋势。NcSec24的分子质量约为80.419 ku,等电点为5.60,分子式为C3671H5653N897O1067S31,平均亲水系数为-0.035;NcSec24不含典型信号肽,可同时定位于细胞核和细胞质;NcSec24含4个结构域(Sec23_trunk、Sec23_helical、zf-Sec23_Sec24和Sec23_BS)与5个保守基序(motif1、motif2、motif3、motif4和motif5);东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫、泰氏康罗汉孢虫的NcSec24聚为一支。【结论】nce-miR-26675通过靶向调控NcSec24的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程。NcSec24是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫和泰氏康罗汉孢虫的Nc-Sec24同源性较高。

狐源兔脑炎微孢子虫极管蛋白2(PTP2)的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立一种特异性好、敏感性高、重复性好的可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,试验首先从疑似感染兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon.cuniculi)的蓝狐脑组织DNA中扩增PTP2基因,并将其与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒pET32a-PTP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,将菌体超声后对表达的重组蛋白进行可溶性分析,并纯化目的蛋白;然后以重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件和临界值的确定建立蓝狐兔脑炎微孢子虫的间接ELISA方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验;最后采用建立的间接ELISA方法对28份经常规PCR方法验证已经感染兔脑炎微孢子虫病的蓝狐血清样品进行检测,并计算符合率。结果表明:表达的重组蛋白的分子质量为45.8 ku,且表达产物以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,经纯化杂带明显减少,纯化后的重组蛋白质量浓度为1.55 mg/mL。间接ELISA方法的最佳包被抗原质量浓度为8μg/ml,最佳一抗稀释度为1∶100,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳封闭条件为37℃、1 h,最佳一抗孵育时间为120 min,最佳二抗稀释度为1∶5 000,最佳二抗孵育时间为60 min,最佳显色时间为20 min。阴、阳性血清OD_(450)临界值分别为0.268和0.302。建立的间接ELISA方法检测蓝狐犬瘟热病毒、蓝狐伪狂犬病毒、蓝狐细小病毒阳性血清均为阴性,可检测到稀释度为1∶3 200的蓝狐兔脑炎微孢子虫阳性血清,批内重复与批间重复变异系数均小于10%。用建立的间接ELISA方法检测28份蓝狐血清样品的阳性样品数为23份,与常规PCR方法的符合率为82.14%。说明试验成功建立了一种可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,该方法特异性好、敏感性高、重复性好,适合在基层推广。

新农药蝗虫微孢子虫AL200801介绍

本文从研发背景、登记情况、产品信息、理化性质、毒性、环境生物安全性评价、作用机理、应用技术等方面对新农药蝗虫微孢子虫AL200801进行了介绍。

昌吉州牛隐孢子虫流行病学调查与防控

隐孢子虫病(Cryptosporidium,sp)是由隐孢子虫引起的一种以腹泻为主要特征的人畜共患的肠道寄生原虫病,该病不仅严重危害了牛养殖业的经济效益,并且患病牛也成为人患隐孢子虫病的重要传染源。因此,本研究针对新疆昌吉州辖区肉牛规模化养殖场内不同生长阶段且具有腹泻、弱犊、营养不良、腹痛、厌食等临床表现的病牛,通过问卷调查和实验室检测等方式开展流行病学调查,以期为肉牛规模化养殖场犊牛隐孢子虫感染制定科学合理的生物安全防控措施提供依据。

蜜蜂微孢子虫病研究进展

蜜蜂是重要的社会经济昆虫,对农业增产和社会生态平衡具有重要作用。蜜蜂微孢子虫是一种专性细胞内真菌寄生虫,严重威胁成年蜜蜂健康。感染微孢子虫的蜜蜂整体生理状态全部异常,包括免疫功能受到抑制、肠道上皮细胞凋亡受到抑制、激素稳态受到干扰、归巢能力受到破坏、寿命缩短、冬季严重死亡,微孢子虫感染还能使蜜蜂更容易受到极端温度、营养胁迫和其他蜜蜂病原体的伤害。因此,本文针对蜜蜂微孢子种类及特点和微孢子虫病的传播感染途径、症状、诊断方法和防治展开综述。

柞蚕微孢子虫感染后柞蚕卵转录组及免疫相关基因功能分析

【目的】柞蚕微孢子虫Nosema pernyi引发柞蚕Antheraea pernyi微粒子病,威胁柞蚕种质资源的保育及生产安全,并且能够经卵垂直传播,因此需要寻找柞蚕体内应对柞蚕微孢子虫侵染后的免疫基因,为后续寻找和培育抗微粒子病新品种提供帮助。【方法】构建柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组,进行GO功能注释和KEGG分析确定免疫相关基因;PCR克隆柞蚕谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因ApGSTo1并进行生物信息学分析;运用RT-qPCR检测ApGSTo1在柞蚕微孢子虫侵染柞蚕产出后0-10 d卵中的表达量。【结果】在感染与未感染柞蚕微孢子虫柞蚕卵转录组检测到的表达基因数为17453,其中显著差异表达基因数目为89个;GO功能注释中细胞解剖实体和催化活性相关基因数量最多,KEGG分析中参与运输和分解代谢、信号转导及消化系统这3个通路的基因数量最多。基于柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组数据分析,将ApGSTo1作为目的基因,PCR克隆及系统进化分析结果证明ApGSTo1属于omega家族GST;感染柞蚕微孢子虫柞蚕卵中ApGSTo1表达量比正常对照组的高,且在产卵后2 d时的表达量极显著高于正常对照组的。【结论】获得了柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组数据,找到了1个免疫相关基因ApGSTo1,从分子生物学和转录水平初步证明了ApGSTo1参与柞蚕卵内的抗柞蚕微孢子虫侵染,还发现了抗柞蚕微孢子虫侵染反应的关键时间为产卵后2 d时,这些结果为后续研究ApGSTo1在抗逆性和氧化还原等功能方面提供研究基础。

隐孢子虫病的流行现状

隐孢子虫病是由隐孢子虫(Cryptosporidium)寄生于人类、家养动物及多种野生动物胃肠道引起的一种严重的人畜共患胃肠疾病。该病不但威胁人类健康,亦严重影响畜牧业发展。近年来随着研究的深入,隐孢子虫的流行表现出许多新的特点,危害远远超出了人们的估计。这些特点主要表现在:感染家畜,增加人类感染风险;与动物其他病原混合感染危害加重;感染野生动物,具有自然疫源性;感染海洋和水生动物,造成水体污染;经水源和食物传播引起人类群体感染;暴发感染对人群危害严重。深入开展隐孢子虫病流行病及防控研究对提高公共卫生水平具有重要意义。

牛隐孢子虫病的综合防控

牛隐孢子虫病是一种常见的寄生虫疾病,感染隐孢子虫会导致牛生产能力下降,特别是犊牛感染后会出现严重的腹泻,有时可导致病牛死亡,给养殖业带来巨大的损失。笔者旨在通过对牛隐孢子虫病的病原特点、流行特点、临床症状及病理变化的综合阐述,提出科学有效的综合防控措施,为养殖场提供牛隐孢子虫病防控策略的参考,保障牛隐孢子虫病的有效防治。

牛隐孢子虫病研究进展与综合防控

牛隐孢子虫病是由牛感染隐孢子虫诱发的一种寄生性原虫病,患病后牛会表现出腹泻、厌食等症状,制约牛的生长发育,严重时可造成死亡。随着养牛业的发展,养殖规模进一步扩大,但存在牛隐孢子虫病高发的情况,疾病在各大养殖场流行,逐渐成为影响新生犊牛最常见的疾病之一,引起了更多养殖人员和防疫人员的重视。当前,在养殖过程中,应加强疾病防控,促进养殖工作有序展开。

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-10660及其靶基因表达谱

【目的】本研究旨在为探究nce-miR-10660调控东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染的作用机制提供理论和实验依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR对前期鉴定到的东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-10660进行表达验证,再通过Sanger测序验证nce-miR-10660的序列。利用相关生物信息学软件预测和分析nce-miR-10660的靶基因。通过RT-qPCR检测nce-miR-10660及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中中肠中的表达谱。【结果】Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果分别证实了nce-miR-10660在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的表达和真实存在。靶向预测结果显示nce-miR-10660共靶向RRDRP和RCDP 42等9个基因;分别有2和6个靶基因可被分别注释到KEGG数据库中的4条通路和GO数据库中的23个条目。RT-qPCR结果显示,相较于东方蜜蜂微孢子虫侵染后1 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量,东方蜜蜂微孢子虫侵染后2 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量显著上调,在东方蜜蜂微孢子虫侵染后4,6和8 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量均显著下调;东方蜜蜂微孢子虫侵染后4,6和8 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中靶基因RRDRP的表达量均显著下调表达;东方蜜蜂微孢子虫侵染后2,4,6和8 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中靶基因RCDP 42的表达量显著下调。【结论】nce-miR-10660在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达;nce-miR-10660及其靶向的RRDRP和RCDP 42在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中差异表达;nce-miR-10660通过正调控RRDRP和RCDP 42表达潜在参与调节东方蜜蜂微孢子虫侵染。

云南省部分地区荷斯坦牛毕氏肠微孢子虫感染情况调查及分析

为了解毕氏肠微孢子虫在云南部分地区荷斯坦牛中的感染以及基因型分布情况,本实验从云南大理、昆明、曲靖和楚雄等牛养殖集中地区总共9个养殖场采集荷斯坦牛粪便样品547份,采用套式PCR结合测序检测并分析毕氏肠微孢子虫感染情况。结果显示,毕氏肠微孢子虫总感染率为4.57%(25/547);各地区的感染率为0~10.53%,其中昆明地区养殖场感染率最高,不同地区间感染率差异显著(P=0.025<0.05)。断奶前犊牛感染率为6.32%(23/364),高于其他月龄牛的感染率,但各月龄牛感染率差异不显著(P=0.052>0.05)。公牛感染率为7.84%(8/102)高于母牛3.82%(17/445),性别间感染率差异不显著(P=0.079>0.05)。进一步通过对样品扩增产物测序分析后鉴定其基因型,结果显示本研究共鉴定出5个基因型,I、J、BEB4为3个已知的基因型和YNY1、YNY22个新拟定的基因型,其中BEB4为优势基因型。在不同地区中,大理检出4种基因型(BEB4、I、YNN1、YNN2),昆明仅检出基因型BEB4,曲靖仅检出基因型J,大理地区基因型分布较为多样;在0~3月龄犊牛检出5种基因型,3~6月龄和成年牛分别只检出基因型BEB4和J;母牛检出4种基因型(BEB4、J、I、YNN1),公牛检出基因型BEB4和YNN2。采用MEGA 7软件中的邻接法(Neighbor-Joining)构建毕氏肠微孢子虫ITS基因的遗传进化树,结果显示基因型YNY1、YNY2和I、J、BEB4分别位于Group 1和Group 2,均具有人兽共患潜力。综上所述,本研究首次调查了云南省荷斯坦牛中毕氏肠微孢子虫的感染情况,并分析了其基因型分布,填补了云南荷斯坦牛毕氏肠微孢子虫的研究空白,为云南荷斯坦牛毕氏肠微孢子虫病的防控提供参考依据。

东方蜜蜂微孢子虫一新孢壁蛋白NcER_100148的鉴定与生物学功能研究

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae作为蜜蜂微孢子虫病的主要病原体,对其侵染机制的相关研究鲜有报道。本研究旨在对团队前期通过质谱鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148进行原核表达,明确其亚细胞定位,并初步探索其生物学功能。【方法】通过在线软件对前期鉴定的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148序列进行生物信息学分析;利用RT-PCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染后西方蜜蜂Apis mellifera成蜂中肠中NcER_100148的表达量;将NcER_100148基因片段克隆至原核表达载体pET30a中,IPTG诱导表达重组蛋白并用于制备多克隆抗体;利用Western blot检测NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的表达量;通过间接免疫荧光和免疫电镜技术分析NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的亚细胞定位;利用Western blot和免疫共沉淀法分别分析重组蛋白NcER_100148与东方蜜蜂微孢子虫几丁质孢子壳(chitin spore coats,CSCs)和极管蛋白NcPTP2和NcPTP3的相互作用关系。【结果】序列分析结果表明,东方蜜蜂微孢子虫NcER_100148预测分子量为12.169 kD,含1个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和1个糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定位点;RT-PCR检测结果表明,NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫感染后4 d时的西方蜜蜂成蜂中肠中开始表达;Western blot结果表明,NcER_100148蛋白能在成熟孢子表面表达,并且能够与东方蜜蜂微孢子虫的CSCs互作;亚细胞定位结果显示NcER_100148定位于东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上;Western blot和免疫共沉淀结果显示重组蛋白NcER_100148能够与极管蛋白NcPTP2和NcPTP3相互作用。【结论】NcER_100148是定位在东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上的一个新型孢壁蛋白,且其可能在孢子内壁的构建、极管的盘绕与固定和参与对宿主的侵染等过程中扮演重要的角色。

家蚕微孢子虫Ubc9蛋白的基因克隆与功能研究

SUMO(small ubiquitin-like modifier)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,Ubc9(ubiquitin-conjugating enzyme)是SUMO修饰靶蛋白过程中唯一的E2结合酶,在SUMO修饰过程中发挥关键作用。本研究克隆了家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)NbUbc9基因的完整开放阅读框。序列分析表明,NbUbc9与所有来源于微孢子虫属(Nosema)的Ubc9聚类在同一大分支上,与同为Nosema属的西方蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)Ubc9同源性最高,说明NbUbc9蛋白在进化上高度保守。qRT-PCR分析表明,家蚕内源性Ubc9的表达量在Nb感染后有所下降,而Nb自身NbUbc9的表达显著增加。对NbUbc9基因RNAi后,Nb基因组DNA的复制水平显著下降,说明NbUbc9在Nb的细胞增殖中起着关键作用。经Pull-down和质谱分析,初步鉴定出有46个家蚕蛋白和8个Nb蛋白可能与NbUbc9相互作用,涉及蛋白质折叠与转运、去泛素化、信号转导等。研究结果为进一步研究NbUbc9在家蚕微孢子增殖中的作用提供了参考,也为开发微粒子病防治药物提供了新的方向。