“没有细胞结构的微小生物—病毒”网络教学设计

如何有效地利用网络信息资源为生物学教学服务，已经成为我们共同面临的一个课题。笔者设计了“没有细胞结构的微小生物一病毒”网络教学案例，在江苏省生物学教学与信息技术研讨会上作了展示，现整理如下：

辽宁沈阳株猫泛白细胞减少症病毒VP2基因扩增及生物信息学分析

【目的】通过生物信息学方法分析1株2022年辽宁沈阳地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)LN3株VP2蛋白的分子特征。【方法】利用FPV胶体金试纸条对临床上表现呕吐、腹泻等症状的患病猫粪便进行检测,提取该病猫粪便的病毒DNA进行FPV VP2基因PCR扩增及测序,使用Seqman软件对序列进行拼接。将所获序列与NCBI数据库中FPV和犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的VP2基因进行相似性比对及遗传进化分析。使用生物信息学软件对该毒株VP2蛋白进行预测,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、糖基化位点、亚细胞定位、二级结构、三级结构等。【结果】FPV LN3株VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;与GenBank上登录的15株FPV同属一个大分支,相似性为98.9%~99.7%;与CPV处于不同分支上。生物信息学软件预测显示,FPV LN3株VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;含有7个潜在N-糖基化位点、86个O-糖基化位点和50个磷酸化位点;VP2蛋白在细胞质、细胞核、线粒体中的可能性分别为43.5%、34.8%和21.7%;VP2蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-转角分别占61.82%、8.90%、24.32%及4.97%,三级结构预测结果与其一致;VP2蛋白共有20个抗原表位。【结论】VP2是FPV遗传变异的关键基因,FPV LN3株VP2蛋白属于亲水性、非跨膜稳定蛋白,共存在20个抗原表位。试验结果为进一步研究FPV VP2蛋白功能及研发新型疫苗提供理论依据。

《没有细胞结构的微小生物——病毒》教学设计

一、教学设计理念 课堂是传授知识的空间，也是师生互动的过程。一个好的、成功的课堂不仅是知识的掌握和理解，对学生各种能力的培养也起着非常重要的作用。本节课自始至终通过教师的引导、帮助和参与，让学生通过分析、交流，自主进行探究，将课堂真正地还给学生，给学生充分的自信。体验科学研究的基本方法。培养学生的探究能力和意识，学会与他人分享和交流信息，提高与他人合作和沟通的能力。

换位思考在生物教学中的应用——“没有细胞结构的微小生物——病毒”教学设计

换位思考是指站在不同的角度和立场来思考问题。新课程倡导学习从学生的生活实际出发，从体验中获取知识。换位思考能够让学生不但站在自己的角度去体验，而且站在教师、科学研究者，甚至是某一种特殊生物的立场上去考虑问题，从而获得关于某个问题的深层次的理解。病毒是一种特殊的生物，它有没有传统意义上的思想和感受，我们现在尚无从知晓，但是病毒作为生物，

“没有细胞结构的微小生物——病毒”一节的教学反思

1 教学过程 “没有细胞结构的微小生物—病毒”是人教版七年级上册第二单元第四章的内容，笔者采用的教学模式是“目标引导，先学后教”，即：激趣导入一目标展示一自主与合作一展示与点拨——盘点收获——目标检测六个环节。具体教学流程如图1所示。

“没有细胞结构的微小生物──病毒”教学案例

本课是义务教育课程标准实验教科书第二单元的最后一章,是学生在了解了生物圈中的单细胞生物和多细胞生物的基础上,认识到生物圈中同时还存在没有细胞结构、寄生在活细胞中的微小生物--病毒,从学生的生活经验出发,逐步引导学生了解病毒的发现、大小、结构、营养方式、种类以及与人类的关系,体现了科学技术与社会进步的关系.本单元属于细胞知识的延伸,与第一节＂生物的特征＂相呼应,而且病毒在生物圈中分布广泛,是生物多样性的重要组成部分,与动植物和人类的关系十分密切,与以后几个单元的学习密切相关.

骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响

背景:基因转染技术正积极地应用于组织再生治疗之中,研究表明骨形态发生蛋白7具有骨诱导特性,可以有效促进成骨细胞的发育以及新骨的形成。目的:探讨骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响。方法:分离、培养羊骨髓基质干细胞,利用重组骨形态发生蛋白7腺病毒(adenovirus bone morphogenetic protein 7,Adeno-BMP7)对第2代骨髓基质干细胞进行基因转染,透射电镜观察转染后细胞超微结构。流式细胞仪检测转染后的细胞周期,Western blot检测骨形态发生蛋白7的表达,Von Kossa染色观察钙结节形态情况。取转染后第3天及相应未转染的骨髓基质干细胞制备珊瑚-细胞复合物,于裸鼠脊柱两侧背部皮下注射4周和8周后进行大体观察和组织学检测。结果与结论:体外细胞超微结构观察可见Adeno-BMP7基因转染骨髓基质干细胞存在活跃的物质合成代谢;流式细胞仪检测发现转染不会对骨髓基质干细胞的细胞周期产生明显影响;Western blot检测转染后的骨髓基质干细胞存在骨形态发生蛋白7蛋白的表达;Von Kossa染色可见转染Adeno-BMP7后的骨髓基质干细胞形成较大的钙结节。经裸鼠皮下回植实验发现,Adeno-BMP7转染后骨髓基质干细胞的成骨能力和成骨质量明显提高。以上结果表明经Adeno-BMP7转染可以有效促进骨髓基质干细胞成骨分化。

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒(FPV)北京株(FPV-BJ 05株)NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%～99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%～98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。

糖生物学专栏导读

糖作为生命体的重要组成成份,承载着很多生物学功能:保护细胞、细胞的结构成份、能量来源与代谢组分、细胞与细胞的识别以及细胞内的信号转导。最常见的人类ABO血型的分子基础就是由血细胞表面的糖链结构决定的,流感病毒侵入宿主细胞则是由宿主细胞表面的唾液酸糖作为受体。

人微小病毒B19分子生物学研究进展

人微小病毒Ｂ１９是微小病毒科微小病毒属中目前已知的唯一致人类疾病的病毒，也是动物病毒中体积最小结构最简单的 ＤＮＡ病毒。能引起传染性红斑、再生障碍性贫血等多种临床病症。近年来许多学者对ＰＶＢ１９的基因组结构特征、复制、转录方式及其特点，结构蛋白和非结构蛋白的特有功能进行了多方面的研究。本文拟对这方面的研究进展作一综述。

靶向抗TIGIT和PVRIG双特异抗体的制备及体外生物性活性的研究

目的制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus receptor-related immunoglobin domain-containing protein,PVRIG)双特异抗体,探究其体外生物学活性。方法用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体,将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析;采用流式细胞术(Fluorescence activated cell sorting,FACS)检测双特异性抗体的结合活性;采用生物干涉膜技术(Bio-layer interferometry,BLI)检测双特异性抗体亲和力;用Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG细胞和293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用;采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度。结果SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度>95%;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95。采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析,其纯度均>90%。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line的EC 50分别为0.16870μg/mL和0.03865μg/mL,与293T-cyno-PVRIG cell line的EC 50分别为0.03714μg/mL和0.03198μg/mL,与Human PVRIG Protein,His Tag的亲和力为1.74E-10M和1.69E-10M。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和TIGIT的人源化抗体hT1与293T-PVRIG cell line的EC 50分别为0.07027μg/mL和0.03121μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line的EC 50分别为0.02028μg/mL和0.02822μg/mL;与Human TIGIT Protein,His Tag的亲和力为8.50E-10M和8.47E-10M。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有阻断PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG相互作用活性,且KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV的EC 50为0.007μg/mL,优于单独人源化抗体hT1(EC 50为0.013μg/mL)和hP1(EC 50为0.048μg/mL)的作用。在含pp65 peptide条件下KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体分泌IFN-r为349.72 pg/mL,明显高于其他抗体。结论KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物。

日探明麻疹病毒感染细胞结合部立体结构

日本研究人员在近日的《自然·结构和分子生物学》网络版上发表论文说，他们从原子层面探明麻疹病毒入侵细胞时起重要作用的蛋白质及其受体结合部位的立体结构，这项成果有望帮助人们开发抗麻疹病毒新药。

日探明麻疹病毒感染细胞结合部立体结构

据新华社东京1月11日电 日本研究人员在10日的《自然·结构和分子生物学》网络版上发表论文说，他们从原子层面探明麻疹病毒入侵细胞时起重要作用的蛋白质及其受体结合部位的立体结构，这项成果有望帮助人们开发抗麻疹病毒新药。

抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的:研制抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的人源噬菌体单链可变区抗体,并探讨其在临床病理学诊断中的应用价值。方法:以大肠杆菌表达的重组HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,利用抗原-抗体亲和性结合的原理,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析,获得HCV NS5A的人源单链抗体;用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV NS5A抗原进行免疫组化鉴定。结果:ELISA结果表明,制备的HCV NS5A人源单链抗体能与HCV NS5A抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别HCV NS5A抗原,与正常肝细胞无交叉反应。结论:此法制备的单链抗体亲和性好,特异性强,且制备方法简便,周期短,为HCV NS5A病原的检测提供了新的有效的检测手段。

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析。结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α2HS糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled coil helix结构的新蛋白、未知功能基因。结论:成功构建HCVNS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法 以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,进行抑制性消减杂交分析。将富集的二次PCR产物与T A载体连接 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑取克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 3 3个阳性克隆 ,经菌落PCR分析显示其中 2 8个克隆含有大小不等的 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。测序及同源性分析显示 ,12种已知基因编码蛋白 ,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS4B反式激活靶基因。结论 成功构建了HCVNS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,为进一步阐明HCVNS4B反式调节的靶基因在肝炎。

利用TAT多肽增强腺病毒对细胞感染效率的研究

蛋白转导多肽本身或携带生物大分子能以一种不明机制的方式高效地穿过真核细胞质膜并且几乎没有组织选择性。这为生物药物研究、基因治疗等领域带来了新的希望。最近有研究表明:来源于HIV-1的TAT蛋白的蛋白转导结构域多肽可以显著地提高重组腺病毒感染细胞和实验动物的效率。在对。HeLa且和Vero-E62种具有不同病毒易感性的细胞进行重组腺病毒感染实验时发现TAT多肽可以明显地提高重组腺病毒对HeLa细胞的感染及在细胞中外源报道基因的表达,但是对Vero-E6细胞却没有效果,表明TAT多肽增强重组腺病毒的感染与靶细胞类型有关,而并不像转导现象那样没有组织差异。这为蛋白转导技术在病毒载体中的应用提供了参考,但其中涉及的蛋白转导的机制有待进一步实验研究。