“自身模板引物”PCR法构建蟋蟀神经肽Grb-AST_7基因串联体

[目的]通过改进的"自身模板引物"PCR法构建Grb-AST7基因串联体。[方法]根据蟋蟀神经肽Grb-AST7氨基酸序列设计合成2条引物,运用改进的"自身模板引物"PCR法进行拼接。[结果]通过拼接,获得了全长570bp、含17个拷贝的Grb-AST7基因串联体。拼接条件以拼接时间20min,25μlPCR体系中含2μl模板引物较合适。[结论]该研究为下一步进行Grb-AST7基因表达及其生物学活性分析奠定了基础。

柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害,目前没有可用的有效药剂和抗病品种,分子检测对黄龙病有效防控至关重要。本研究对国内外常用的常规PCR和巢式PCR检测引物进行评价,针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因,构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。结果表明,使用Es Taq MasterMix对感染Candidatus Liberibacter asiaticus(C Las)的柑橘样品进行常规PCR检测时,在评价的16对引物中,OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高,推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品;各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系,部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增,F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系,且最高可稳定特异检出10^(5)倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-3) ng/μL),是灵敏度最高的引物组,OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-2) ng/μL),是适用扩增体系最广的引物组;构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中,pnrdB83扩增效率最接近100%,且在2次重复试验中波动最小,稳定性最强,并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时,各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小,是本研究筛选的最佳质粒。本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。

牛结核病荧光定量PCR引物探针的组合筛选比较

为比较牛结核病荧光定量PCR(qPCR)不同引物探针组合的特异性和敏感性,验证其临床检测效果,选取国际、国家、行业、地方标准及文献报道的11组qPCR鉴定引物探针组合,采用牛分枝杆菌基因组DNA国家二级标准物质、参考菌株核酸和临床奶样对其进行比较、验证。结果显示:11组引物探针均无非特异性扩增,表现出良好的特异性;国标IS1081引物检测灵敏度最高,最低检测限可达1.4×10^(-1);除国标Mtb(结核分枝杆菌)引物外,其他引物探针组合重复性良好(CV<10%);30份临床样品中国标IS1081引物阳性样品检出率明显高于其他引物。结果表明,国标IS1081引物探针组合特异、灵敏、临床检测效果更优,推荐用于实验室qPCR检测牛结核病。

高中生物学PCR技术中的引物设计

聚合酶链式反应(PCR)是江苏高考生物试题中的常考内容,PCR技术的用途并不局限于最初、最基本的获取目的基因。PCR技术的使用场景极其灵活,通过引物设计,可以达到融合基因、定点诱变等效果。文章对PCR技术中的引物设计思路进行分类,介绍其衍生的各种应用,为教师教学提供参考。

革胡子鲇生长激素基因表达定量PCR分析的引物设计与评估

以革胡子鲇(Clarias gariepinus)为试验对象,对其生长激素(GH)基因进行荧光定量PCR(qPCR)的引物设计与评估。将合成的5对引物通过常规PCR电泳结果选择出符合条件的GHF-GHR引物,并进行qPCR引物的评估。结果显示:扩增GH基因片段的引物GHF-GHR扩增时熔解曲线为单一峰,说明引物具有良好的特异性;通过标准曲线得出GHF-GHR引物的扩增效率为93.3%,标准曲线的R2值为0.982,说明引物的扩增效率良好。上述结果说明GHF-GHR引物能用于待检样本的GH基因表达的qPCR分析。

大肠杆菌asd基因PCR引物设计及其长模板PCR扩增

目的获得大肠杆菌全长ａｓｄ基因。方法采用计算机引物设计软件，长模板ＰＣＲ扩增法及限制性内切酶酶切分析。结果设计一对Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因ＰＣＲ引物；经长模板ＰＣＲ扩增获得１５１０ｂｐＰＣＲ扩增片段；经限制性内切酶酶切分析，证明该片段与电脑查询的Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因酶切谱相同。结论以本文设计的引物用长模板ＰＣＲ扩增法得到的片段初步确认为Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因。

笋用林3种竹笋夜蛾多重PCR鉴定技术的建立与应用

【目的】建立鉴定竹笋夜蛾物种的多重PCR技术,用于浙江省笋用竹的3种竹笋夜蛾幼虫的物种鉴定。【方法】针对COI基因的变异区设计物种特异性多重PCR引物;优化影响多重PCR反应的参数,建立鉴定竹笋夜蛾的多重PCR技术;采用标准DNA模板评价多重PCR技术的敏感性和特异性;利用多重PCR技术对林间采集的竹笋夜蛾幼虫进行物种鉴定。【结果】针对3种竹笋夜蛾COI基因的变异区设计了3条物种特异性多重PCR引物,与通用引物LCO1490配合使用,扩增竹笋基夜蛾、竹笋禾夜蛾和笋秀夜蛾COI基因片段,大小分别为290、390和590 bp。优化后的多重PCR鉴定技术的反应体系为:2×HotStart Taq PCR预混试剂10μL,10μmol·L^(-1)的引物LCO1490、JYE290、HYE390和QTYE590各0.5μL,DNA模板1μL,加ddH2O补足20μL。优化后的多重PCR鉴定技术的反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸30 s;72℃下延伸10 min,循环数为35。多重PCR鉴定技术对笋秀夜蛾的最低检出限为0.01 ng·μL^(-1),对竹笋禾夜蛾和竹笋基夜蛾的最低检出限低于0.001 ng·μL^(-1)。林间样品鉴定结果表明,所有38份DNA都能扩增出明显的特异性条带,鉴定成功率100%;经测序验证,本研究的技术鉴定的物种与经COI基因序列鉴定的物种一致。【结论】研究建立了浙江省笋用竹的夜蛾的多重PCR鉴定技术,能够快速高效鉴定浙江省笋用林内竹笋夜蛾幼虫的物种,该技术具有鉴定周期短、灵敏度高、特异性强、准确度高等优点。

淡水鱼类环境DNA宏条形码引物的筛选及其在千岛湖的应用

基于环境DNA(eDNA)技术的鱼类多样性监测方法因具有灵敏度高、对目标生物无伤害以及成本低等特点,近年来在国内外得到了广泛应用。eDNA方法的有效性往往取决于宏条形码引物的选择,尽管目前已经有一些鱼类环境DNA宏条形码引物,但较少有研究综合评估这些引物的检出效果。本研究评估了来自COI、Cytb、12S rRNA和16S rRNA基因的29对鱼类e DNA宏条形码引物(包括本研究设计的2对和从国内外文献中引用的27对引物),首先基于计算机模拟PCR(in silico PCR)进行了初步分析,随后通过高通量测序对其中效果较好的17对引物开展了更进一步的验证,结果显示:计算机模拟PCR结果良好的引物在进行高通量测序时并非全部表现良好,表明引物的筛选不能仅仅依靠计算机模拟PCR;具有更长扩增片段长度的宏条形码引物并没有获得理想中更好的扩增效果,表现效果好的引物大多是扩增片段长度处于200~300 bp之间的引物;相对于COI和Cytb而言,12S rRNA引物与16S rRNA引物均具有良好的扩增效果,适宜作为鱼类环境DNA宏条形码而用于鱼类多样性研究;同时,鉴于当前的鱼类DNA条形码数据库尚不完备以及不同引物的特性不同,使用多对引物将大大增加物种的检出概率和e DNA研究的可信性。本研究展示了eDNA在评估生物多样性方面的潜力,有助于将来的鱼类eDNA研究,从而为鱼类多样性的保护提供参考。

荧光定量PCR法鉴别蛤蚧定喘丸中醋鳖甲

目的建立蛤蚧定喘丸中醋鳖甲的DNA分子鉴定方法。方法根据鳖、佛罗里达鳖线粒体基因序列的差异设计特异性引物TS和AF,进行荧光定量PCR和方法学考察,然后对市售蛤蚧定喘丸中醋鳖甲进行鉴定。结果含有鳖、佛罗里达鳖的DNA样品仅与相应引物扩增后可检测到荧光信号,有特定温度单一峰,T_(m)分别为77.45、79.72℃。该方法的检测限为10 copies/μL,重复性较高(CV<1%)。10批蛤蚧定喘丸中有9批仅检出鳖DNA,被鉴定为正品;1批同时检出鳖DNA和佛罗里达鳖DNA,被鉴定为掺伪品。结论本研究所建立的方法可快速、可靠地鉴定蛤蚧定喘丸中醋鳖甲炮制品成分,有助于监管含醋鳖甲成方制剂的质量,并为成方制剂中动物药成分的专属性鉴定研究提供新途径。

采用实时荧光定量PCR法检测大曲中的3种高温放线菌

建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)方法对大曲中3种高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris、T.intermedius和T.daqus)进行特异性定量检测。根据T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus全基因组中特异性单拷贝核心基因recA、mdH、gyrA为参考序列分别设计了一对可扩增278、233、291 bp片段的引物;经特异性、有效性、准确性实验显示,在常见的13种白酒酿造微生物中,引物TV、TI、TD分别可特异性检测T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus,检测范围为2.82~8.82 lg copies/μL,加标回收率95%~105%。进一步对大曲发酵过程样品检测,结果显示,T.vulgaris含量在呈现波动趋势,在第5天达到最高,为(6.06±0.02)lg copies/g;T.intermedius含量呈现先上升后下降的趋势,在第7天达到最高,为(6.33±0.13)lg copies/g;T.daqus含量在0~12 d呈现波动趋势,在12~14 d下降,随后一直上升,发酵结束时含量最高,为(7.62±0.02)lg copies/g。该研究建立的RT-qPCR方法可对大曲发酵过程中3种高温放线菌进行特异性鉴定和快速定量,为进一步监测高温放线菌在白酒酿造过程中的功能提供了方法。

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测用引物和探针的筛选

本试验针对非洲猪瘟病毒基因保守序列设计了四对引物和探针用于微滴式数字PCR检测,经过数字PCR梯度反应体系及条件优化、特异性试验、灵敏度和线性范围试验,最终确认了一对引物和探针结果较为理想,其中引物浓度为900 nmol/L,探针浓度450 nmol/L,最适退火温度为54.2℃。

简并PCR技术在疾病检测中的应用

普通PCR引物对目的基因扩增的单一特异性,限制了其在临床疾病检测中的通用性范围,而多重PCR需要避免若干引物对之间二级结构的干扰,应用同样受到一定的限制。简并PCR技术中简并性引物是基于基因保守区域的分析并结合简并碱基而设计,可以检测出高度相似的靶基因,具有高效性、灵敏性、特异性和低成本的特点,目前已被广泛应用于多个领域。综述了简并PCR技术在临床、食品安全、动植物疫病、寄生虫、水产养殖等领域疾病检测中的应用,并对其优缺点进行了讨论,以期为简并PCR的进一步发展以及在其他领域的应用提供参考和指导。

基于平行模板的重叠延伸PCR优化策略

基于平行模板的一步法重叠延伸PCR是传统基因定点突变的简化方案,其瑕疵是不完全延伸片段交叉互补会产生野生型干扰。为寻找原方案下形成交叉互补的关键因素,提高其定点突变效率,对诸多相关因素进行了分析。发现调整中介引物浓度稀释比可以增加目标突变体含量,但难以彻底消除野生型干扰;而基因长度则明显影响终产物构成。据此提出两步法重叠延伸PCR优化策略,先分别在两个小管中扩增突变位点上、下游片段,再直接混合继续PCR扩增目标基因突变体。以克隆细胞周期蛋白E的定点突变为例进行验证,得到90%阳性率。优化的两步法重叠延伸PCR方案既保持了相对简化的操作步骤,又明显提高了突变效率,是对传统重叠延伸PCR定点突变技术的重要改进。

聚焦关键能力,优化高考复习——以高中生物学“PCR引物”试题归类分析为例

在进行该部分的复习时可将"引物的设计""引物的选择""引物的数量计算""引物扩增片段长度计算""引物的退火温度""PCR技术在基因工程中的应用"等相关知识点与试题相结合,围绕PCR引物开展深度分析,拓宽学生知识储备.

基于PCR-SSP技术的RhCE血型基因型检测方法

目的 基于序列特异性引物PCR(PCR-SSP)技术建立一种用于检测临床标本红细胞RhCE血型基因型的快速定型方法。方法 将2023年9至12月宁波大学附属第一医院收检的152例乙二胺四乙酸抗凝血样分别采用试管法、间接抗人球法和微柱凝胶卡法检测RhD血型和RhCE血型。采用硅基质柱法提取样本DNA。采用Sanger测序法选择RhCE基因标准品序列。采用PCR-SSP法确定检测RhC和Rhc、RhE和Rhe两对等位基因的4对序列特异性引物。采用TA克隆技术得到重组质粒并评估序列特异性引物的灵敏度和抗干扰性能。采用PCR-SSP法检测样本,并与血清学结果进行一致性评价。结果 用表型分别为CCee、CcEe、ccEE的3个标本成功确定不同RhCE基因型的标准品序列。4对序列特异性引物能有效区分RhC和Rhc、RhE和Rhe两对等位基因。序列特异性引物在对应等位基因1:128干扰下仍能检测出且灵敏度为10~4~10~5拷贝数/μL。临床样本RhE、Rhe和Rhc基因型检测结果与表型一致性为100.00%,但RhC基因型与表型一致性只有92.76%,其中RhD阳性背景人群中的一致率为98.39%,RhD阴性背景人群中一致率为88.89%。结论 PCR-SSP技术在红细胞RhCE血型基因型快速鉴定方面具有可行性,检测RhE、Rhe和Rhc基因型与表型具有较高的一致性,对RhC基因型的检测,需区分不同RhD血型背景,建议使用两种及以上的方法进行综合判断。

利用MPprimer设计引物并优化扩增条件以提高多重PCR效率的实验研究

多重PCR技术广泛应用于多个研究领域,其中引物设计及扩增条件是提高多重PCR实验效率的关键因素.为探讨优化多重PCR实验的方法,以小鼠5个看家基因为研究对象,使用实验室新近开发的MPprimer程序设计多重PCR引物,并通过改变多种反应条件来优化多重PCR实验.结果表明,MPprimer程序能够设计出理想的多重PCR引物,并且通过对退火温度及延伸时间进行优化,可显著提高多重PCR实验效率,对于提高基因表达的规模化检测能力具有积极的促进作用.

棉蚜(Aphis gossypii)种群寄主分化和季节分化的微卫星引物PCR研究

通过对棉蚜群体进行室外观察、室内培养和分子遗传标记的 DNA多态性分析 (用 3个微卫星序列为引物进行PCR)等研究 ,结果表明 :1 .冬寄主 (木槿、石榴和花椒 )上棉蚜种群分化较小 (种群相似性指数在 0 .833～ 0 .91 7之间 ) ,而冬寄主种群和夏寄主 (棉花和南瓜 )种群之间有较大的分化 (种群相似性指数在 0 .589～ 0 .756之间 )。2 .棉蚜自然种群是由体色不变的生物型 (干母为黄色 ,其后代始终为黄色 )和体色可变型生物型 (干母为绿色 ,其后代有绿色和黄色两种体色 )组成的混合种群。3.黄色小型蚜 (伏蚜 )来源于混合类群 ,但主要来自绿色干母多代选择分化的黄色后代 。

水稻PCR扩增模板的快速制备

用碱处理水稻嫩叶,取碱处理水稻叶片浸出液直接用作PCR扩增的模板,扩增结果稳定、准确,与常规提取的DNA扩增效果相比没有显著差异。用此方法制备的模板室温下2周之内、4℃下3周之内、-20℃下4个月以上扩增结果不变。此方法所需试剂均为常规试剂,具有需要材料少、成本低、简便、快捷等优点,尤其适合材料比较宝贵的转基因水稻的预筛选和大样本量的PCR检测,为分子标记技术的实际应用创造了条件。

过量DMSO显著降低低模板浓度PCR扩增的特异性

DMSO通常经验性地用于提高PCR扩增的效率 ,但是过量的DMSO可以显著降低特异序列的扩增效率 ,尤其是导致非特异性扩增的现象却被忽视。在 6 %的DMSO存在时 ,开始出现非特异条带 ,同时特异扩增产物减少。本文首次报道DMSO对PCR产物特异性的影响并确定了克服上述现象产生的途径 ,即通过增加模板 -引物的比例消除非特异条带。而通常提高复性温度只能部分减少非特异产物 ,不能避免非特异扩增。本文结果有助于提高常规PCR ,尤其是分子遗传学分析中经常使用的随机扩增多态性DNA (randomamplifiedpolymorphicDNA ,RAPD)检测的准确度。

中国玉米新品种DNA指纹库建立系列研究 Ⅲ.多重PCR技术在玉米SSR引物扩增中的应用

根据21对玉米SSR引物扩增片段大小范围组成不同的引物组合进行多重PCR反应的研究。在与单一PCR相同的反应条件下,47个两重PCR组合出现5种不同的扩增情况,其中30个组合扩增正常;10个三重PCR组合中有9个组合扩增正常;两个四重PCR组合中有1个扩增正常,这些筛选出的正常扩增的组合可应用于今后玉米DNA指纹库构建研究中。研究表明,应用与单一PCR完全相同的反应条件,大部分能够获得正常扩增的多重PCR组合,在此基础上提出了简化的多重PCR优化程序。