肺癌病理应用支气管冲洗细胞块免疫组化链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法染色的诊断效果及检出率评价

目的探讨肺癌病理应用支气管冲洗细胞块免疫组化链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP)染色的诊断效果及检出率。方法选取2017年2月至2021年12月广东省开平市中心医院收治的70例经支气管冲洗液检查阳性患者作为研究对象。采用液基薄层细胞学(TCT)技术制备细胞块,分别采用免疫组化SP法、苏木精伊红染色(HE)进行常规细胞学检查,比较两种检测方法诊断效能及不同肺癌类型免疫组化SP法检查后不同抗体阳性表达率比较。结果免疫组化SP法对恶性肿瘤诊断的灵敏度为96.15%、准确度为95.71%,均高于HE染色的69.23%、70.00%(P<0.05),特异度为94.44%,高于HE染色的72.22%,但差异无统计学意义。免疫组化SP法对肺癌病理类型总检出率高于HE染色,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化SP法对肌上皮(p63)、细胞角蛋白5/6抗体(CK5/6)、细胞角蛋白7(CK7);甲状腺转录因子-1(TTF-1)、突触素(Syn)、人表皮生长因子受体-5(CD56),增殖细胞的核抗原(Ki67),天冬氨酸蛋白酶(Napsin-A)表达阳性率均高于HE染色,差异统计学意义(P<0.05)。不同类型肺癌患者p63、CK5/6、CK7、TTF-1、Syn、CD56、Ki67、Napsin-A阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论支气管冲洗液细胞块免疫组化SP法染色对肺癌有较高的诊断价值,对不同类型肺癌有较高的检出率及鉴别率,具有重要的临床意义。

寡核苷酸片段载体的酶切连接和无缝克隆构建方法比较

目的比较酶切连接和无缝克隆方法在构建pCGS3-CK载体上的优缺点,为寡核苷酸片段载体的构建提供参考。方法酶切连接是需要合成两条互补的寡聚核苷酸单链,然后经过退火形成具有黏性末端的双链结构片段,在DNA连接酶的作用下与具有相同酶切的线性化载体连接,形成环状质粒。无缝克隆是在目标序列两端各加上15~20个与载体序列同源性的碱基,然后经过退火形成双链结构的目的片段,在重组酶的作用下与线性化的载体连接,形成环状质粒。结果从阳性率角度进行比较,酶切连接的阳性率为95.65%,而无缝克隆的阳性率为89.13%。结论与无缝克隆方法相比,用酶切连接方法构建寡核苷酸片段载体阳性率高,实验成本低。

应用“酶切连接”克隆法构建TALEs

TALEs是在植物病原菌黄单胞杆菌(Xanthomonas)上发现的一类天然的DNA结合蛋白,其重复域已经成为模块化构建单元,用于人工DNA结合蛋白的构建。人工TALEs能够用于多种基因工程操作,包括转录调节和基因组编辑。为了在常规分子生物学实验室稳定、经济地构建TALE-TFs和TALENs,本文采用TALE Toolbox试剂盒,运用PCR扩增和"酶切-连接"克隆法构建人工TALEs。结果表明,该构建策略是一种快速高效构建TALEs的方法,能够在1周内完成TALEs构建。

质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法检测沙眼衣原体

目的:建立高度灵敏特异的质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法(Gap-LCR-ELISA)检测沙眼衣原体(Chlamy-diatrachomatisCT)。方法:根据CT共有隐蔽性质粒设计并标记4条寡核苷酸探针,对6型CT标准株和鹦鹉热衣原体及其他常见泌尿生殖道病原菌行Gap-LCR-ELISA。结果:质粒Gap-LCR-ELISA可检测出6型CT,并与其他病原体无交叉反应,其最低检测限为2.5个原体(elementarybodiesEB)比PCR敏感10倍。结论:质粒Gap-LCR-ELISA对检测CT感染具有极高的灵敏度和特异度,适宜于我国进行大规模CT流行病学调查。

缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法检测孕妇沙眼衣原体感染

目的:用缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附(Gap-LCR-ELISA)法检测重庆地区孕妇沙眼衣原体感染,以了解围生期沙眼衣原体(CT)的感染现状。方法:以512名孕妇首段尿(FVU)及配对宫颈刮片为研究对象,按照扩大金标准,采用质粒探针和外膜蛋白探针Gap-LCR-ELISA法用于不同类型临床标本检测CT感染。结果:①孕妇的CT感染呈很强的隐匿性,由扩大金标准所确证的CT真阳性共42例,所检重庆地区孕妇的CT感染率为8.2%(42/512),其中88.1%(37/42)可同时从尿道和生殖道检出CT,而另9.5%(4/42)和2.4%(1/42)仅能单独分别从生殖道或尿道检出。②Gap-LCR-ELISA用质粒与外膜蛋白作为探针检测FVU中CT的敏感性分别为90.48%和71.43%(P<0.05),质粒Gap-LCR-ELISA用于宫颈刮片和FVU两种标本的敏感性分别为97.62%和90.48%(P>0.05),特异性均为100%。结论:质粒Gap-LCR-ELISA法用于孕妇FVU以检测围生期无症状CT感染患者,是一种非侵袭性的、高度敏感特异的、适合于发展中国家和地区进行大规模流行病学调查的方法。

质粒缺口-连接酶链反应-ELISA法检测重庆地区围生期孕妇沙眼衣原体感染及基因分型

目的:用质粒缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)-ELISA法研究重庆地区围生期孕妇沙眼衣原体(CT)感染的现状及流行的主要基因型别,为其疫苗的研制提供分子流行病学依据。方法:以512例孕妇的首段尿(FVU)及其配对新生儿的鼻咽拭子为标本,用质粒Gap-LCR-ELISA法检测CT感染者,对阳性母、婴配对标本DNA行omp1-VS4-PCR扩增,产物行双链DNA直接测序并作基因分型。结果:所检重庆地区孕妇CT感染率为7.42%,母婴垂直传播率为15.79%,以阴道分娩为主要传播途径。6对阳性母婴配对标本的CT基因序列一致,其中5对为E型,1对为H型,再次证实了CT的垂直传播途径。结论:质粒Gap-LCR-ELISA法可用于围生期无症状CT感染孕妇的大规模流行病学调查。重庆地区围生期CT流行型别仍以E型为主。

短小芽孢杆菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的分泌表达

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌H12中克隆了编码β-1,4-葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及其酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行表达。结果表明,该基因大小为1980 bp,共编码659个氨基酸;对β-1,4-葡聚糖内切酶结构域分析表明,该酶由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成;平板实验结果表明,β-1,4-葡聚糖内切酶基因在重组大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;SDS-PAGE电泳图谱表明该酶的分子大小约为73 kDa。

半合成-酶连法克隆EFsec基因及其初步表达分析

目的将缺失一段编码序列的真核硒代半胱氨酸-tRNA特异性延伸因子(EFsec-)基因补齐,并克隆到真核表达载体进行初步表达分析。方法采用人工合成法合成所缺失的基因片段,然后利用EFsec-基因序列中靠近5'端存在的天然酶切位点进行酶连,再用PCR方法扩增出拼接产物,并将其克隆到pcDNA3.1(-)载体。采用脂质体转染法转染HEK293T细胞后应用RT-PCR法检测EFsec基因的表达。结果准确快捷地将EFsec-基因补齐了其5'端缺失的基因序列,并成功地构建了其表达质粒pcDNA3.1-EFsec,转染哺乳动物细胞后检测到了EFsec基因的显著表达。结论半合成-酶连法可以高效快捷地补齐并克隆缺失的EFsec-基因,提供了一种拼接基因的有效策略和方法,同时也为EFsec基因的下一步研究奠定了基础。

一株嗜热梭菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因大小为1 101 bp,共编码366个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明该基因在E.coli BL21(DE3)PLYS中得到了有效表达,相对分子质量约为60 kDa,纯化后重组酶活力为103 U/mL;酶学性质实验结果表明:酶最适pH值为5左右,最适反应温度为55℃,且此酶具有良好的耐热性(75℃左右)和pH值稳定性。

甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。

黑曲霉内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的分子克隆与特征解析

利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC 3. 2. 1. 89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因agh A在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了重组菌GS115(p PIC-aghA)。摇瓶培养条件下,重组酶Agh A的酶活为130 U/m L,高于大多数已报道的半乳聚糖酶的酶活。酶学性质的研究表明,该酶的最适反应pH值和温度分别为4. 5和45℃,且在pH 4. 0～6. 0或30～50℃具有较好稳定性。大部分金属离子和EDTA对重组酶Agh A的酶活没有显著影响; Fe3+对其活性有强烈的抑制作用;而Hg2+则可使Agh A几乎完全失活。该酶对半乳聚糖的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为400 mg/(m L·min)和0. 08 mg/m L。此外,重组酶Agh A还可以水解土豆浆,产生半乳二糖、半乳三糖和少量半乳四糖等低聚半乳糖。

克隆酶供体免疫测定法检测25-羟基维生素D试剂盒的检测意义与性能评价

目的:介绍25-羟基维生素D的临床背景,并对复星长征公司研制生产的25-羟基维生素D测定试剂盒(克隆酶供体免疫测定法)进行初步方法学评价,为临床应用提供依据。方法:依据《临床化学体外诊断试剂(盒)通用技术要求》对25-羟基维生素D测定试剂盒(克隆酶供体免疫测定法)进行分析性能评估分析与验证,并评价其与其他厂家试剂的相关性。结果:试剂启用后可稳定2周;与英国Immunodiagnostic Systems Limited(IDS Ltd)公司生产的试剂测试结果相关性良好,其相关系数为0.9680。结论:复星长征公司研制生产的用克隆酶供体免疫测定法检测25-羟基维生素D试剂盒各项分析性能完全能够达到指标要求,其检测结果可为临床诊断提供科学依据。

淀粉液化芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)基因组,通过PCR克隆了该菌的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因全长。结果显示,该基因全长843bp,ORF为717bp,编码239个氨基酸,计算相对分子质量为26800,等电点为6.07。经Blast分析,该序列与基因库中的淀粉液化芽孢杆菌(M15674)同源性最高(97%)。该基因已被GenBank接受(AY205562.1)。用BamH和Xho双酶切目的片段和表达载体pET-30a(+)后相连接,构建了重组表达载体pET-amy,并导入BL21细菌中表达,酶学特性表明SDS-PAGE电泳在26000左右有表达蛋白带,该工程菌总酶活达90.74U/mL,是出发菌的3倍,最适温度在60℃左右,pH值在4～10之间。该工程菌可作为酶活高的理想材料,用以构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。

测定食品中呋喃它酮代谢物3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫吸附法

目的 建立以多克隆抗体为基础的测定食品中呋喃它酮代谢物3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的间接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA).方法 以4-甲酰基苯氧基乙酸(4-FPA)为修饰剂,合成AMOZ半抗原衍生物,并使其分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)交联制备得到免疫原和包被抗原,经免疫动物(兔),获得抗NPAMOZ(AMOZ与衍生化试剂2-硝基苯甲醛所形成的结合物)的多克隆抗体.用酶联免疫分析法测定AMOZ(以NPAMOZ形式).结果 在包被抗原为2.5 ng/mL,抗体为1:300 000稀释,酶标二抗为1:10000稀释的优化条件下,ELISA测定AMOZ(以NPAMOZ形式)的IC50值(标准曲线中吸光度抑制至最大吸光度值50％时所对应的待测物浓度)为1.86 ng/mL.抗体与呋喃它酮的交叉反应率较高(70.7％),与AMOZ的交叉反应率仅为0.32％,与其余三种硝基呋喃抗生素及它们的代谢物以及其它八种药物的交叉反应率很小(＜0.01％),表明抗体的特异性高.四种市售的肉样(鱼肉、虾肉、鸡肉、猪肝)用作加标实验,加标浓度分别为0.5、1.0和5.0 ng/g,加标样品经衍生化处理后用ELISA测定,回收率为75.6％～112.2％,批间相对标准偏差(RSD)为8.3％～17.5％.结论 本法具有高灵敏性和高特特异性,能用于动物产品中AMOZ的检测.

郑州与北京地区HCV5′-非编码区酶切基因分型对比研究

目的 探讨郑州与北京地区丙型肝炎病毒 (HCV)基因型分布情况。方法 分别对郑州地区的 90例抗 -HCV阳性献血员及北京地区 2 6 9例肝炎患者血清采用逆转录套式聚合酶链反应 (RT- nested- PCR)进行 HCV RNA检测 ,其中郑州地区 80例呈 HCV RNA阳性 ,北京地区 5 6例呈 HCV RNA阳性 ,并对两地区病例的阳性 PCR产物进行5′-非编码区 (5′- NCR)酶切基因分型。结果 郑州地区 HCV 型感染 5 5例 (6 8.8% ) ,HCV 型感染 2 1例 (2 6 .2 % ) ,HCV / 型混合感染 4例 (5 .0 % )。北京地区 HCV 型感染 4 9例 (87.5 % ) ,HCV 型感染 7例 (12 .5 % ) ,无 HCV / 型混合感染。结论 HCV 型感染是郑州地区的优势株 ,其次是 HCV 型 , / 型混合感染较少见。而北京地区主要以 HCV 型为主 ,HCV 型感染少见。

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 应用半巢式聚合酶链反应 -微孔板杂交法 (半巢式PCR -MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 1 0倍 ,半巢式PCR -MPH法特异性强。该法重复法好 ,批内CV值 <1 0 % ,批间CV值 <1 5 % ;该法在包被浓度为 4mg L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 1 0pmol mL探针杂交 3 0min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、敏感性和特异性均高 ,无放射性和EB染料污染 ,适于临床样本的常规检测。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮

建立了检测氯胺酮的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)。实验最佳测定条件:抗原包被浓度为2.0mg/L、氯胺酮单克隆抗体浓度为10.2mg/L,生物素化羊抗小鼠IgG(Biotin-IgG)和酶标链霉亲和素(SA-HRP)的最佳反应浓度分别为0.29和1.0mg/L。在此优化条件下,方法的线性范围为0.1～1000μg/L;检出限为0.03μg/L。氯胺酮生物样品的加标回收率为94%～102%。与酶标二抗体系ELISA法相比,BA-ELISA具有更高的灵敏度,适于低浓度氯胺酮的检测。

GoldenBraid酶切连接反应体系的优化

旨在获得更为高效稳定的GoldenBraid(GB)酶切连接组装反应体系。通过优化GB反应中酶切时间、缓冲体系、限制性内切酶和底物配伍来提高有效克隆的效率,确定最佳反应体系。结果显示,4 min酶切时间,1μL FastDigest Buffer(10×)缓冲体系,1 mmol/L ATP,0.5μL FastDigest Esp3I或FastDigest Eco31I,元件供体载体与受体载体的摩尔比3∶1时,有效克隆比例接近99%,是优化前(BsmBI 8%、BsaI 23%)的4倍以上,此时酶切连接效率接近100%。与原始方案相比,通过体系的优化,可以在更少内切酶用量(原方案为1μL)的情况下,显著提高有效克隆比例,表明本方法能提高GB系统的酶切连接效率和实用性。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定牛奶中雌三醇

建立了检测牛奶中雌三醇的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA),实验最佳工作条件为,包被原浓度为125 ng/m L,生物化抗体的稀释倍数为1∶16000,缓冲体系为pH=7.4的0.01 mol/L的PBS缓冲溶液,体系中甲醇浓度低于5%,生物素化抗体孵育时间和亲和素-HRP孵育时间均为30 min。在此最佳条件下,方法的检测范围(IC20~IC80)为0.149~3.27 ng/m L,灵敏度IC50=0.689 ng/m L。建立了液-液提取样品前处理方法,前处理净化后稀释10倍可消除基质效应,雌三醇牛奶样品加标回收率为94.9%~115.2%,CV<15%。与ELISA法相比,BA-ELISA具有更高的灵敏度,适于低浓度雌三醇的检测。

一种制备19-去甲睾酮完全抗原及单克隆抗体的方法的建立

本文旨在建立一种制备19-去甲睾酮完全抗原及单克隆抗体的方法。通过丁二酸酐将19-去甲睾酮（19BNT）半抗原与牛血清白蛋白（BSA潲联得到偶联物（19BNT—HAS—BSA），以此进行免疫、筛选，最终获得3株阳性杂交瘤细胞（4D5，6F2，7E7），并制得相应的单克隆抗体。用间接竞争酶联免疫法，对7E7株抗体进行鉴定，发现：抗体的亲和常数为3．35×108L／mol，半抑制浓度为0．35ng／mL，表明此抗体对19-去甲睾酮有很强的亲和力；以19-去甲睾酮为参照物，抗体对丙酸诺龙的交叉反应率为80．3％，对甲基睾酮、睾酮、群勃龙、己烯雌酚等的交叉反应率均小于0．2％，表明此抗体具有良好的特异性。由此可知，7E7株抗体可用于对19-去甲睾酮、丙酸诺龙的免疫分析。