牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

Reading man皮瓣修复术治疗皮肤缺损的疗效观察

目的:探讨Reading man皮瓣修复术在全身不同部位皮肤缺损及其预防瘢痕增生的临床疗效。方法:回顾性分析2021年1月—2023年10月该科应用Reading man皮瓣修复术治疗全身不同部位皮肤软组织缺损的20例患者临床资料。结果:所有患者皮瓣均成活。术后随访时间为3~24个月,所有皮瓣血运良好,色泽红润,质地柔软,外观适宜,局部皮肤张力较低,手术切口瘢痕增生不明显,切口周围软组织无明显形变,周围关节活动度正常。所有患者均恢复良好,疗效满意。结论:Reading man皮瓣特有的设计可以很好地解决全身多部位较大的皮肤软组织缺损,尤其在术中可以最大限度地减少正常皮肤的切除,术后外观、功能及皮肤瘢痕增生均有较满意的表现,且不存在自体皮移植带来的供皮区损伤。

牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的Taq Man荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强。分别以1.0×10~7拷贝/μL~1.0×10~1拷贝/μL的p EASY-Mmm和p EASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×10~1拷贝/μL,敏感性较高。对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性。本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重Taq Man荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

鸡毒支原体 Taq Man实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和Taq Man探针,建立鸡毒支原体Taq Man实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit,CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R^(2)=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体Taq Man探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。

羊贝氏柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)实时荧光定量PCR方法,根据GenBank上收录的C.burnetii RSA439株com1基因序列(CP040059.1)保守区设计特异性引物和探针,并构建重组质粒及优化反应条件,以期建立一种检测贝氏柯克斯体的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,该方法所建立标准曲线线性关系良好;敏感性试验结果显示,最低检出限为2.45×10^(2) copies/μL,与PCR最低检出限为2.45×10^(4) copies/μL相比较,灵敏度提高了100倍;对羊支原体、羊流产衣原体、羊布鲁氏菌等均无交叉反应,批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于3%,说明特异性、重复性好;利用该方法对收集的126份样品进行检测,结果显示样品阳性率为9.52%,常规PCR检测阳性率为7.14%,符合率为90.47%。该方法可为贝氏柯克斯体临床上快速检测及防控提供技术支持。

DOPO-MAN改性大豆油基水性聚氨酯丙烯酸酯的制备

本文以9,10-二氢-9-氧杂-10-磷杂菲-10-氧化物(DOPO)、马来酸酐(MA)和二乙醇胺(DEA)为原料制备出DOPO-MAN,以其为改性剂制备出可UV-LED固化的DOPO-MAN改性大豆油基水性聚氨酯丙烯酸酯乳液。将乳液与光引发剂(TPO)混合均匀后经UV-LED光固化,制成固化膜。实验结果表明,当DOPO-MAN的含量为20%时,固化膜的极限氧指数为24.3,UL-94测试也达到了V-1级别。

诺如病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的设计与优化

为设计一种快速、高灵敏度检测诺如病毒(Norovirus,NV)的方法.本文通过检索参考NCBI数据库中收录的国内典型流行的NV毒株BJSMQ的基因序列NC_039476.1,合成了NV的标准重组质粒,根据NV的ORF1基因保守序列设计一组特异性引物和荧光探针;通过正交试验进行程序及试剂反应体系的优化,设计TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明该检测方法具有高灵敏度,最低检测限可达1.2 copies/μL,且在标准重组质粒浓度1.2×10^(5)~1.2×10^(0) copies/μL范围内具有较好的线性关系,其R^(2)=0.9907;该方法特异性强,在病毒的混合重组质粒样液中仅与NV病毒反应;组内和组间的重复性良好,变异系数(CV)值均小于2%;在数字PCR试验中进一步验证了该方法的可行性.本文设计的TaqMan荧光定量PCR检测方法可用于NV毒株的快速准确检测,有望成为NV诊断的有效工具.

基于TaqMan MGB探针的大豆北方茎溃疡病菌快速检测

为准确快速检测检疫性真菌大豆北方茎溃疡病菌,根据大豆北方茎溃疡病菌及其近似种的模式分离物ITS序列差异,设计并合成1对特异性引物和1条MGB探针,建立大豆北方茎溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明:该检测方法能特异性检测大豆北方茎溃疡病菌。灵敏度试验结果表明:最低检测限量为10μL反应体系中总DNA含量1.0 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.5μmol·L^(-1),探针终浓度0.6μmol·L^(-1)。实际样品检测结果表明:该方法可用于疑似受大豆北方茎溃疡病菌侵染的进境大豆样品的检测与初筛。此方法准确、快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后续处理,可作为大豆北方茎溃疡病菌检测防控方法。

薄壳山核桃疮痂病菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

疮痂病是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害,带菌植物材料是传播疮痂病的重要来源。准确、灵敏、快速的检测方法可为该病害流行规律调查和防控提供有力的依据。本文通过比较薄壳山核桃疮痂病菌Venturia effusa及其近似种之间的ITS序列差异,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法。特异性检测结果表明,该方法可以检测不同地区的薄壳山核桃疮痂病菌菌株,而对其近似种以及薄壳山核桃上的其他真菌均没有信号。本研究建立的检测方法对薄壳山核桃疮痂病菌DNA的最低检测限可达0.5 pg/μL。该方法用于田间样品检测时,检测时间仅需1 h,远快于常规的分离培养法。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法为薄壳山核桃疮痂病菌的快速检测和监测提供了有力工具。

长孢轮枝菌Taq Man-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法

长孢轮枝菌是一种在我国局部地区新近出现且危害性极大的植物病原真菌。根据长孢轮枝菌及其近似种的actin序列差异,设计并合成特异性引物和探针,建立了长孢轮枝菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测长孢轮枝菌;灵敏度试验结果表明,最低检测限量为10μL反应体系中总DNA含量10 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.8μmol/L,探针终浓度0.8μmol/L,优化后的整个反应过程约1 h。实际样品检测结果表明,该方法可用于疑似受长孢轮枝菌侵染的萝卜样品检测与初筛。此方法快速、灵敏,检测过程完全闭管,无需PCR后续处理,为早期快速检测长孢轮枝菌提供了重要参考。

番茄褐色皱果病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)Taq Man荧光定量RT-PCR方法,本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)基因序列设计了4组特异性引物和Taq Man探针,构建了标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和实际样品的检测效率进行评估。结果显示,该方法特异性强,与番茄花叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒等9种病毒均无交叉反应。建立的标准曲线的R^(2)为0.999,扩增效率为102.096%,检测灵敏度为10 fg/μL,与EPPO PM 7/146(1)推荐的CaTa28、CSP1325方法相当,是常规RT-PCR的100倍;采用该方法成功从60份番茄和辣椒叶片、种子样品中检出10份阳性样品。建立的Taq Man荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中ToBRFV的快速精准检测。

综采液压支架中部跟机多模态人机协同控制系统

我国煤矿智能化综采工作面建设处于初级阶段,液压支架电液控自动化技术已广泛应用,但目前液压支架单一固化的自动化控制逻辑难以适应复杂、多变、动态的工作面生产场景,现场实际控制过程仍大多采用自动化+人工干预方式。针对综采工作面复杂场景中液压支架人机交互协作任务需求,提出液压支架中部跟机多模态人机协同控制系统的理论方法与技术原理。首先,设计了人工式、分工式、批准式、否决式4种人机协同模态,以煤层地质、瓦斯粉尘、采煤机速度、液压支架智能水平、系统状态、岗位工技术水平、任务负荷等为判别因素,构建了基于AOG的液压支架人机协同模态选择模型,实现了人工、机器偏好的模态选择。然后,设计了液压支架中部跟机人机协同控制决策机制,提出液压支架中部跟机再次调控策略AI推理技术思路,利用现场数据学习人工操作经验,分别构建了液压支架是否再次调控决策树分类模型和再次拉架时间贝叶斯回归模型,基于上述模型开发了液压支架人机协同控制决策程序,实现了基于多模态与或推理和再次调控策略AI推理的液压支架人机协同控制。最后,采用云-边-端架构软硬件技术,开发了液压支架多模态人机协同控制系统,实现了模型进化、运算推理、程序执行等液压支架多模态人机协同控制功能。该系统在沙曲二矿3404工作面进行了工业试运行,相比于系统使用前,该工作面液压支架中部跟机效率平均提高2%。

基于“马赛克战”的水下有人-无人作战使用探讨

通过对“马赛克战”概念的背景和特点进行分析,提出基于马赛克的水下攻防作战运用构想,构建基于马赛克的水下有人-无人作战网络,分析多域背景下水下OODA作战网络的构成,利用OODA作战环理论对水下马赛克作战网络作战能力进行分析,并提出水下马赛克作战网络对抗单个平台和对抗作战网络的使用方法。最后,从通信组网、集群使用、人工智能、察打一体等4个方面对“马赛克战”概念下水下无人航行器装备使用提出建议。

单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究

为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。

“经济人”还是“政治人”:半导体超级企业的策略选择机制

在美国点名施压之下,为何全球半导体超级企业在中美两国间的策略选择呈现出较为明显的差异?既有研究对于高科技超级企业在大国科技竞争背景下的决策机制关注不足。超级企业的策略选择受到外部大国关系和自身“经济人”“政治人”属性的影响,当体系内大国关系处于合作的良性状态时,“经济人”逻辑占据上风,企业能够在全球市场中自主决策,理性地追求自身利润最大化;当大国关系为竞争甚至走向对抗时,“政治人”逻辑则占据上风,企业“政治人”属性的强弱决定其如何应对美国的政治胁迫,进而决定能否进入下一阶段遵循“经济人”逻辑的决策环节。台积电、英伟达和阿斯麦的策略选择能够为这一分析框架提供经验证据。该研究有助于理解美国对华科技竞争背景下高科技超级企业的决策机制,也对中国和中国企业在技术变革时代分析合作伙伴和竞争对手的行为逻辑具有一定启发意义。

中国式现代化的纵向叙事逻辑

在中国式现代化的叙事逻辑阐释上,目前学界呈现一种“重横向逻辑,轻纵向逻辑”的不均衡态势,“逻辑起点—逻辑中介—逻辑终点”的纵向叙事逻辑屈指可数。以马克思唯物史观为指引,中国式现代化的纵向叙事逻辑在于:现实的人是中国式现代化得以形成的最大可能,是中国式现代化的逻辑起点。中国式现代化的逻辑中介作为连接逻辑起点(最大可能)和逻辑终点(最大结果)的中间枢纽,包括以马克思主义为指导的思想中介、以党的全面领导为根本的组织中介、以高质量发展为任务的主题中介、以国家制度体系为架构的基础中介、以中华民族伟大复兴中国梦为导向的目标中介、以面临的内外部环境为形势的条件中介。人的现代化是中国式现代化得以实现的最大结果,是中国式现代化的逻辑终点,包括以人民为中心的现代化和人的自由全面发展。科学合理地精准定位并论证好中国式现代化的纵向叙事逻辑,对于新时代全面推进社会主义现代化建设事业意义重大,成为推进中国式现代化向纵深发展的时代要求。

The Significance of Constructing TCM Psychosomatic Medicine from the Holistic View of the Unity of Nature and Man

With the development of medical technology, the problem of fragmentation of medical research has become increasingly prominent, and a series of iatrogenic diseases, drug-induced diseases and drug toxicity and side effects have resulted in an increase in the number of diseases. In the face of these problems, the medical concept has been re-examined and re-thought. The concept of the holistic view of the unity of nature and man in traditional Chinese medicine has certain enlightenment for dealing with the problems in the current medical development. Based on the holistic view of the unity of nature and man, the overall connection between human’s heart and body and nature is explained, and the further construction of TCM psychosomatic medicine is conducive to guiding the diagnosis and treatment of clinical diseases, and providing new enlightenment for the current medical concept thinking and clinical disease research.