基于紫胶红素的靶标有色化免疫层析试纸条联检大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌

为摆脱免疫层析试纸条对配对抗体的依赖,文章设计了一种新型靶标有色化免疫层析试纸条,使用紫胶红素和十二合水硫酸铝钾媒染剂,通过先媒后染的方法,实现了免疫层析试纸条的“可视化”。验证结果显示,该试纸条对大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌的检测限均达到了106 CFU/mL;同时,与常见食源性致病菌间不存在交叉反应,在鸡胸肉、鸡蛋、牛奶等食品基质中能够在增菌9 h内检出。文章成功设计了一种操作简单、检测成本低,更易国产化的快速检测免疫层析试纸条,为后续免疫层析试纸条的设计提供了新思路。

食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测技术研究进展

近年来,因食源性致病菌造成的食品中毒正在不断增加,严重威胁了人类的健康,大肠杆菌(E.coli)O157∶H7由于其低感染剂量和高致病性等特点引起了研究人员和世界卫生组织的高度重视。因此精准快速的检测食品中的E.coli O157∶H7对食品安全问题有着重要的意义,是预防和控制食源性疾病传播的重要技术,为此本文对E.coli O157∶H7的常规检测方法、免疫学法、分子生物学法和其他方法进行论述,介绍了这些方法的优缺点,对各种方法进行了整体比较,以期为有关工作者在选择检测方法或研发新方法提供参考。

基于分子生物学方法的食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7检测技术研究进展

对检测大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)的预富集技术和聚合酶链式反应(PCR)技术、等温扩增技术、基于成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白质系统(CRISPR/Cas)的技术等分子生物学方法进行论述,介绍了这些方法在E.coli O157∶H7检测中的研究进展,并对其检出限和靶基因等进行了比较,以期为E.coli O157∶H7的快速检测提供参考依据。

大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体SF08的分离、表征及在食品中的应用

本研究通过双层平板法从湖水中分离、纯化出一株大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体,并命名为SF08。对其生物学特性、基因组序列及在即食鸡爪中的抑菌效果进行分析。结果表明,SF08由长约124 nm的可收缩尾巴和直径约76 nm的多面体头部组成。最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)为0.01;潜伏期为20 min,裂解期为20~110 min,爆发量为66 PFU/cell;在pH 3~12和30~70℃条件下能保持较高的活性。基因组全长59704 bp,G+C含量为56.52%,共有72个开放阅读框(ORF)。SF08在4℃下可以极显著地抑制即食鸡爪中模拟污染的大肠杆菌O157:H7(P<0.01)。本研究表明SF08具有较好的生物学特性及安全性,为后续研发和制备天然杀菌剂提供理论基础和参考。

一种可快速检测大肠杆菌O157:H7的纸基传感器的制备与应用

大肠杆菌O157:H7是一种致病性较强的食源性细菌,通常在生制食品中被检出,一旦被人体摄入会引发肠道疾病,严重危害公众健康。本研究制备了功能化的长余辉探针,并结合适配体的特异性识别功能构建了能快速检测大肠杆菌O157:H7的纸基传感器,检出限达7.5×10^(3) CFU·mL^(-1)。该传感器可同时检测3个样品,具有特异性好、操作简便和环境友好的特点,可应用于大量样品中大肠杆菌O157:H7的快速筛查。

大肠杆菌烈性噬菌体vB_EcoM_JN03的分离、鉴定及其抑菌效果研究

【目的】大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是一种重要的食源性致病菌。抗生素的不当使用导致E.coli O157:H7多重耐药和泛耐药成为一个日益严重的问题,研究其天然杀菌剂——烈性噬菌体,对于防控多重耐药E.coli O157:H7污染具有理论意义和实践应用价值。【方法】以多重耐药E.coli O157:H7为宿主菌,采用双层琼脂平板法,从污水中分离烈性噬菌体,对其生物学特性进行表征和全基因组序列分析,并评价该噬菌体应用于食品中对E.coli O157:H7的抑菌效果。【结果】成功分离纯化了一株可裂解E.coli O157:H7的噬菌体,命名为vB_EcoM_JN03(GenBank登录号:OR885871)。vB_EcoM_JN03属于有尾噬菌体目,肌尾病毒科;其最佳感染复数(MOI)为0.01,潜伏期为30 min,120 min后到达平稳期,裂解量80 PFU/cell;其在30~60℃和pH 4~12范围内效价稳定。vB_EcoM_JN03的基因组为双链DNA,全长158142 bp,G+C含量44.63%,编码206个开放阅读框(ORF),不含已知编码的毒力、抗生素耐药和溶源性基因。vB_EcoM_JN03在4℃下可显著抑制牛奶和牛肉样品中污染的E.coli O157:H7。【结论】经分离、鉴定的E.coli O157:H7烈性噬菌体vB_EcoM_JN03对宿主菌具有良好的抑制作用,有望作为一种天然杀菌剂防控E.coli O157:H7污染食品。

牦牛腹泻源大肠杆菌O抗原血清型鉴定与HPI相关基因检测

为了研究牦牛腹泻源大肠杆菌的O抗原血清型及强毒力岛(HPI)相关基因的携带情况,试验对采自西藏山南地区某牦牛养殖场的80份腹泻牦牛肛拭子样本进行细菌的分离与鉴定,并对分离的大肠杆菌菌株进行F17毒力因子检测、O抗原血清型鉴定及HPI相关基因irp3、irp5、irp2、ybtA、fyuA、irp8、ans_-tRNA_-intB检测。结果表明:从80份肛拭子样本共分离到28株大肠杆菌。在28株分离菌株中,有5株菌株携带F17毒力因子,共有17种O抗原血清型。其中O158检出率最高,为50.00%(14/28);O125、O119、O146检出率较高,分别为39.28%(11/28)、39.28%(11/28)、35.71%(10/28);而O127、O18检出率最低,均为14.29%(4/28)。HPI相关基因irp3、irp5、irp2、ybtA、fyuA、irp8、ans_-tRNA_-intB的阳性率分别为35.71%(10/28)、28.57%(8/28)、32.14%(9/28)、32.14%(9/28)、28.57%(8/28)、28.57%(8/28)和28.57%(8/28)。说明分离到的牦牛腹泻源大肠杆菌优势血清型为O158,且存在携带HPI相关基因的情况。

黄芩汤及其减味方颗粒对感染大肠杆菌O78雏鸡肠道菌群和炎性反应相关性的影响

本试验以黄芩汤及其减味方颗粒饲喂人工感染大肠杆菌O78雏鸡后,研究肠道菌群与溶菌酶、炎症因子及Toll样受体间的相关性。首先,制备黄芩汤及其减味方颗粒,然后将19日龄伊莎褐雏鸡随机分为空白对照组(CG)、模型组(MG)、黄芩汤颗粒组(HQT)、黄芩汤减大枣颗粒组(ADZ)、黄芩汤减甘草颗粒组(AGC)、黄芩汤减白芍颗粒组(ASY)、黄芩汤减黄芩颗粒组(AHQ)、恩诺沙星组(ENR),每组10只。5个中草药组饲料中添加相应颗粒剂(500 mg/kg·BW)、恩诺沙星组添加量为10 mg/kg·BW,混饲7 d后,除空白对照组,其余7组的每只鸡胸肌注射0.6 mL大肠杆菌O78菌液,继续混饲5 d。试验结束后,16S rDNA测序法测定肠道菌群;ELISA法检测血清溶菌酶和炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α)水平;RT-PCR法检测脾脏Toll样受体(TLR4、TLR5、TLR15)相对表达量;采用Pearson法分析其相关性。结果表明:经黄芩汤及其减味方颗粒饲喂染病雏鸡后,其肠道菌群结构与溶菌酶、炎症因子含量及Toll样受体相对表达量间呈现一定的相关性。黄芩汤及其减味方颗粒可通过回调染病雏鸡肠道菌群结构,下调血清中溶菌酶、炎症因子水平以及脾脏Toll样受体相对表达量,从而达到治疗鸡大肠杆菌病的目的。试验结果可为黄芩汤及其减味方颗粒治疗鸡大肠杆菌病分子机制的系统研究提供参考依据。

纳米金与纳米金花标记的免疫层析法的建立及快速检测大肠杆菌O157∶H7的比较研究

为实现大肠杆菌O157∶H7早期现场的快速检测,该试验通过化学还原法与介导生长法制备了AuNPs与AuNFs作为标记探针,建立2种用于大肠杆菌O157∶H7现场快速检测的免疫层析试纸条,并对2种试纸条的的灵敏度、特异性和准确性进行检测。结果显示,所建立的2种免疫层析方法均可在15 min内检出食品中的大肠杆菌O157∶H7,其中AuNP试纸条最低检出限为3.2×10^(5)CFU/mL,AuNFs试纸条最低检出限为3.2×10^(4)CFU/mL,与单增李斯特菌、沙门氏菌、坂崎肠杆菌等常见食源性致病菌没有交叉反应。对人工污染果冻、牛奶和牛肉等样品AuNPs试纸条分别在前增菌5、6、5 h时检出,AuNFs试纸条分别在前增菌5、5、4 h时检出,且不受食品复杂机制的影响。结果表明,所建立的2种免疫层析试纸条灵敏度高、特异性强、操作简便,适用于大肠杆菌O157∶H7现场快速检测。

冀东南地区鸡致病性大肠杆菌的分离、O血清群鉴定及药敏试验

对2015年3月至2024年2月自河北省唐山市、沧州市、衡水市、石家庄市、邢台市和邯郸市等发病鸡群疑似大肠杆菌病的病死鸡病变部位分离的163株致病性大肠杆菌(APEC)进行了生化特性测定、O抗原血清群鉴定及药敏试验。结果表明所分离的菌株均符合大肠杆菌生化特征。试验用5种(O1、O2、O57、O65、O78)大肠杆菌单因子阳性血清进行O血清群鉴定,确定了94株O血清群,占鉴定菌株数的57.67%(94/163),其中O1(3株)、O2(26株)、O57(6株)、O65(37株)和O78(22株),O65、O2和O78为优势菌株,而O57和O65血清群菌株为国内外首次报道,应引起鸡病研究者特别是养鸡生产者重视。8种药物(氨苄西林、新霉素、多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠、替米考星、环丙沙星、头孢噻呋和氟苯尼考)的药敏试验结果表明受试的8株APEC均对新霉素有所敏感外,对其他药物均有不同程度的耐受。

基于抗体-适配体夹心生物传感器检测大肠杆菌O157:H7

大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种重要的与公共卫生相关的食源性病原体。抗体分子是体液免疫应答中最重要的效应分子,具有多种生物学活性,最主要的生物学功能是与相应抗原特异性结合。适配体是体外合成的较短DNA序列,可通过识别特定区域和靶标特异性结合。利用抗体和适配体的特异性识别功能及免疫磁珠的捕获作用和磁分离,并通过多克隆抗体和裁剪得到的适配体搭建生物传感器,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)可以实现对靶标在(8×10^(3))-(8×10^(6))CFU/mL范围内的定量检测,检测限为800 CFU/mL。

大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

本文采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金溶液标记大肠杆菌O157:H7抗体(6C1E5),然后将其包被于金标垫上,再将大肠杆菌O157:H7抗体(10G1A2)和兔抗鼠IgG分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线,研制出的大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析快速检测试纸检测灵敏度达104 CFU/mL,并与鼠寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌等8种菌株无交叉反应,显示出较强的特异性。

中国科学院华南植物园揭示表达肠出血性大肠杆菌O157:H7抗原的转基因生菜具有口服疫苗功效

出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种危害严重的食源性致病菌,能引发腹泻、出血性结肠炎,以及溶血性尿毒综合症等。该病原菌的宿主是以牛为主的反刍动物,可随宿主粪便排放到环境中,通过食物、水感染人类。面对EHEC O157:H7的感染,尚缺乏有效的治疗方案,给宿主接种疫苗则能较好地预防相关疾病暴发。鉴于EHEC O157:H7在动物粘膜表面定植,能激活粘膜免疫反应且成本低、使用方便的植物口服疫苗或能取代传统疫苗真正地走入市场。

复方救必应对葡聚糖硫酸钠联合大肠杆菌诱导肠道损伤的保护作用

旨在探究复方救必应(CIRC)对葡聚糖硫酸钠(DSS)联合大肠杆菌诱导肠道屏障损伤的保护作用。将30只体重(20±2)g昆明雌鼠随机分成3个处理组,每组10只,分为空白组(CON)、模型组(DE)和CIRC预防组(CDE)。CON组饮用纯净水,DE组和CDE组自由饮水(含3%DSS溶液)5 d,第6天DE组和CDE组灌胃0.5 mL含菌量10^(8) CFU/mL的大肠杆菌O157:H7菌液,之后饮用纯净水;试验期间CDE组灌胃3.64 g/kg CIRC,CON组和DE组灌胃等量生理盐水,1次/d,连续给药10 d。每天评估小鼠体重变化、疾病活动指数(DAI);末次给药12 h后,收集小鼠血液、结肠、肝脏和肾脏,评估结肠长度,HE染色观察结肠组织的病理学变化,ELISA法测定血清中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、髓过氧化物酶(MPO)和脂多糖(LPS)的含量,实时荧光定量PCR法测定闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和闭合蛋白(Occludin)基因表达量,平板计数检测大肠杆菌O157:H7感染后小鼠器官载菌量。结果显示:与DE组相比,CDE组小鼠体重显著增加(P<0.001),DAI显著降低(P<0.001),结肠长度缩短被显著抑制(P<0.001),血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MPO和LPS含量显著降低(P<0.01),ZO-1和Occludin的mRNA表达量显著提高(P<0.05),并且显著抑制了大肠杆菌O157:H7从肠道转移至肝脏和肾脏(P<0.001)。结果表明:CIRC对DSS联合大肠杆菌诱导小鼠肠道损伤具有较好的保护作用,其作用机制可能与CIRC维持肠道机械屏障,阻止大肠杆菌O157:H7的定殖和转移,进而抑制全身性炎症反应有关。

大肠杆菌快速检测系统设计与实现

食品安全是民生问题之一,与人们的生活密不可分。大肠杆菌O157:H7是一种典型的致病菌,传统的大肠杆菌检测方式比较耗时且需专业的操作人员,如何能进行大范围、快速、易操作的大肠杆菌检测是亟待解决的问题。通过差分脉冲伏安法检测大肠杆菌浓度与电流的关系,设计电化学横向流动免疫分析平台,提出基于电化学和嵌入式单片机技术的快速检测方法。经测试,该系统的检测误差小于4.5%,系统重复误差小于3.7%,最低检测浓度达到102 CFU/mL,检测时间为10 min,可有效用于大肠杆菌的快速检测。

肠出血性大肠埃希菌O157:H7毒力岛及毒力因子的研究进展

肠出血性大肠埃希菌(Entero-hemohaggic E.coli,EHEC)可引起人类和动物的严重传染病。EHEC包括编码肠细胞脱落位点致病岛或与其相关的基因,通过比较基因组分析显示,EHEC O157:H7菌株包含177个基因组岛称为O岛(OIs),包含1387个基因,编码新型的毒力因子逐渐被发现,揭示了该菌的致病新机制,成为新型疫苗研究热点,本文综述了O岛编码毒力因子新进展。

不同提取及扩增方法检测大肠杆菌DNA的性能比较

大肠杆菌O157∶H7是一种危害性极大的食源性致病菌,为实现大肠杆菌O157∶H7的快速检测,分别采用碱加热裂解法、TritonX-100加热裂解法、溶菌酶加十二烷基硫酸钠(SDS)裂解法、SDS加蛋白酶K裂解法及热裂解法5种方法提取大肠杆菌O157∶H7基因组DNA,考察了环介导等温扩增(LAMP)和实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)扩增法对所提取DNA的检测效果,并建立最佳的核酸快速提取样品预处理方法.结果表明,以碱加热裂解预处理提取的大肠杆菌O157∶H7基因组DNA为检测样本时,LAMP扩增及qPCR扩增法的检测性能最好,检出限达到10^(1)CFU/mL,与常规商品化试剂盒提取所得菌液基因组DNA的检测性能一致.所建立的碱加热裂解样品预处理方法耗时短、成本低,无须进行复杂的核酸提取,操作简单,可用于大肠杆菌O157∶H7的快速检测.

大肠杆菌O8、O9和O89血清型三重PCR检测方法的建立

为建立一种快速鉴定O8、O9和O89血清型大肠杆菌的三重PCR方法,根据GenBank登录的3种血清型大肠杆菌O抗原合成基因簇序列,设计3对检测引物,通过优化反应条件建立三重PCR方法。结果:经条件优化后的三重PCR方法可有效鉴别O8、O9和O89血清型的大肠杆菌,具有良好的特异性,对其他肉羊养殖场常见血清型的大肠杆菌和致病菌无特异扩增条带;敏感性检测显示,三重PCR方法对O8和O89血清型的最小检出量为10 pg/μL,对O9血清型的最小检出量为100 pg/μL;采用该方法对临床分离的大肠杆菌进行检测,结果与传统血清凝集方法一致。综上,本研究建立的三重PCR方法可快速、准确、特异地对O8、O9和O89血清型大肠杆菌进行检测,为养殖及肉品加工环节大肠杆菌的流行病学研究提供了更加快捷的检测手段。

鸭源致病性大肠杆菌O抗原与毒力基因检测及药敏试验

【目的】探究荣昌、大足和隆昌三地鸭大肠杆菌分离株的O抗原、毒力基因及耐药性。【方法】将2014年—2021年鸭病料中分离得到的107株细菌在无菌条件下接种于麦康凯培养基中划线进行培养纯化,通过16S rDNA基因扩增测序和生化试验进行细菌鉴定,采用PCR技术对O抗原和16种毒力基因进行检测,采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验。【结果】107株分离株鉴定为大肠杆菌;O抗原鉴定试验鉴定出9种O抗原,其中优势抗原为O78(37.00%)、O7(25.00%),O121和O145(均为15.00%),并检测到5株O78+O145和O7+O145融合株;共检测出11种毒力因子,其中强致病性毒力基因有Tsh基因(检出率为25.23%)、fyuA基因(检出率为31.78%)、estB基因(检出率为31.78%)、Vat基因(检出率为2.80%)、iucA基因(检出率为44.56%)。3种毒力基因ompA、yijP和ibeB的携带率最高,分别为100.00%、96.26%和85.98%;药敏试验结果表明分离株对氨基糖苷类药物、米诺环素和多黏菌素最为敏感,对大环内酯类药物和克林霉素耐药,分离株均为多重耐药菌,30.00%的分离株表现为7重耐药。【结论】本研究鉴定到107株鸭源致病性大肠杆菌,其致病性和耐药性较强,毒力基因携带情况和耐药性检测发现大肠杆菌的致病力与其耐药性存在一定关系;O抗原检测发现了5株新型O抗原融合株,优势O抗原不断变化,说明西南地区大肠杆菌遗传结构正发生变化,可能存在新的菌体抗原。本研究结果为中国西南地区鸭大肠杆菌病防控及疫苗制备提供依据。

免疫磁分离结合胶体金免疫层析法快速检测大肠杆菌O157∶H7

以抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体偶联磁珠制得免疫磁珠;以胶体金标记的抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体为标记抗体,抗大肠杆菌O157∶H7多克隆抗体和驴抗鼠二抗分别作为检测线和质控线成分制备胶体金免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离和胶体金免疫层析法相结合应用于大肠杆菌O157∶H7的现场快速检测中。结果表明:1 mL 7.6×103CFU/mL菌液经过免疫磁珠分离富集后,用胶体金免疫层析法检测可得到阳性结果。对于10 CFU/g大肠杆菌O157∶H7污染的食品样本,经过6 h预增菌,免疫磁珠分离和胶体金试纸条检测72 min即可检出。本方法的建立对于食品中有害物质的现场快速检测具有重要意义。