1株悬浮培养的Vero细胞驯化及其生物学特性研究

目的 将贴壁培养的Vero细胞驯化成悬浮培养细胞,并对其生物学特性进行研究。方法 采用无血清培养和“摇床适应法”对细胞进行培养优化,对其进行成瘤性、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析、透射电子显微镜形态,以及对流感病毒敏感性检测。结果 成功建立悬浮细胞系Vero-S,Vero-S细胞生长期在24~72 h,平台期在108~144h之间,衰退期在144h以后,细胞PDT为36 h,细胞密度在14.01~14.88×10^(8)个/L之间,细胞平均圆度在0.73~0.75之间,细胞直径在12.12~14.44μm之间。Vero-S细胞在裸鼠皮下形成肿瘤,而悬浮培养前的Vero细胞不具有成瘤性;STR显示为猴源细胞系;电镜下细胞结构完整;Vero-S细胞对流感病毒感染不敏感。结论 悬浮细胞系Vero-S细胞的生长经历与贴壁细胞类似的生长期、平台期、衰退期,且细胞大小均一,建立的悬浮培养基能够支持Vero-S细胞高密度生长。STR结果表明悬浮Vero细胞具有完全的遗传稳定性,透射电镜下与贴壁Vero细胞无明显区别。为细胞悬浮驯化培养技术提供参考价值,并可用于细胞致肿瘤的机理研究。

新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)内毒素检查方法比较

目的为新型冠状病毒(简称新冠病毒)灭活疫苗(Vero细胞)的细菌内毒素检查和质量控制提供技术支持和理论基础。方法利用凝胶法、光度测定法[包括动态浊度(TKA)法、微量动态显色(mKCA)法]测定并比较新冠病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液和成品中内毒素浓度。结果3种方法测得的供试品内毒素浓度均符合规定(原液为不超过5 EU/600 SU,成品为每剂≤5 EU),且后2种方法既能用于定性检测也能用于定量检测,特别是mKCA法下鲎试剂用量更少。结论mKCA法是检查该疫苗内毒素浓度的最适宜方法,具有灵敏度高、稳定性强、鲎试剂用量少、数据完整和可追溯、人为操作误差较小的特点。

传染性法氏囊病病毒疫苗株B87在DF-1细胞和Vero细胞感染性研究

为比较传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)疫苗株B87对DF-1细胞和Vero细胞易感性,对比了IBDV B87株感染两种细胞后的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、病毒基因组dsRNA、半数组织感染量(median tissue culture infective dose,TCID 50)水平、病毒载量及VP2基因表达水平。结果显示,IBDV B87株感染后,DF-1细胞CPE程度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒基因dsRNA荧光密度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒载量荧光密度高于Vero细胞,且DF-1细胞中病毒滴度(105.423±0.03296 TCID 50/0.1 mL)极显著高于Vero细胞中病毒滴度(102.592±0.03428 TCID 50/0.1 mL,P<0.01),VP2基因表达量显著高于Vero细胞(P<0.05)。说明IBDV B87株对DF-1细胞的感染性高于Vero细胞。

无血清全悬浮培养Vero细胞系的建立及生物反应器培养参数优化

为建立无血清全悬浮培养Vero细胞系,并使其在反应器中高密度生长。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)引进贴壁培养型Vero细胞,通过降低血清浓度和改变培养液的方式获得1株无血清全悬浮培养型Vero细胞,扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型等特性进行检定;通过Box-Behnken试验对生物反应器pH、溶氧和搅拌转速等3个培养参数进行优化,确定最优培养参数。结果显示,筛选的Vero悬浮细胞形态呈圆形、饱满、透亮,大小均匀,呈现较好的悬浮生长状态;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体及外源病毒检查均为阴性;染色体数目为58或60的占75%;用响应面分析法得出的最优培养参数培养Vero细胞,细胞最高密度可达4.5×10^(6)cells/mL。结果表明,成功筛选出了适应无血清悬浮培养的Vero细胞,通过优化培养参数,可在生物反应器中高密度生长。

Vero细胞生长过程中葡萄糖消耗量与细胞数量关系的研究

目的:建立一种应用于片状载体培养的Vero细胞计数方法。方法:Vero细胞于细胞瓶内培养,分别于24 h、48 h、72 h、96 h和120 h取样检测上清液中葡萄糖含量,同时消化细胞并计数。以葡萄糖累计消耗量为X轴,以细胞收获数量为Y轴,获得葡萄糖累计消耗量和细胞数量的关系方程,从而建立一种细胞计数的方法。通过计算反应器中细胞生长消耗的葡萄糖量来计算细胞数量,从而优化控制细胞生长。结果:得到葡萄糖消耗量与细胞数量线性方程为Y=4.107×10~8X;Vero细胞在反应器内培养6 d,累计消耗葡萄糖71.28 g,所获得细胞数量为2.93×10^(10)个。结论:建立了葡萄糖消耗量与细胞数量的线性关系,即每消耗1 g葡萄糖对应的细胞数量为4.107×10~8个,可作为片状载体细胞培养过程中细胞计数的参考。

犬新孢子虫Nc-1株在MDBK、Vero和MDCK细胞中的培养比较

为了分析新孢子虫在3种不同宿主细胞内的生长情况,该试验采用犬新孢子虫Nc-1株,将其与牛肾细胞(MDBK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)和犬肾上皮细胞(MDCK)在37℃条件下培养10 d,每天观察比较3种细胞在虫体入侵前后的形态变化并记录虫体数量,绘制虫体生长曲线。结果表明:犬新孢子虫Nc-1株在MDBK、Vero和MDCK细胞中均能够正常生长。其中,Nc-1株在入侵Vero细胞的第6天可以较快达到生长高峰期,而在MDBK和MDCK细胞中生长较慢,在第7天才能达到虫体数量的最大值,且MDCK细胞中虫体数量最少。因此,除Vero细胞外,MDBK细胞也可作为一种培养新孢子虫良好的细胞系。该试验为深入了解新孢子虫感染机制和选择合适的体外培养模型提供重要参考。

盐霉素体外对猪流行性腹泻病毒的抑制效果

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病,给全球养猪业造成巨大的经济损失,但目前仍无有效的疫苗和治疗药物。盐霉素(salinomycin, SLM)是一种常用的抗生素,具有不易产生耐药性、排泄迅速、残留量极低的优点。为明确SLM对PEDV的抑制作用,首先通过TCID_(50)(tissue culture infective dose)检测PEDV在Vero细胞上的增殖规律,进一步经CCK-8试验和细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)测定SLM的半数细胞毒性浓度(half-cytotoxic concentration, CC_(50))和其对PEDV的半数抑制浓度(median inhibition concentration, IC_(50)),最后建立SLM、PEDV和Vero细胞的作用模型,利用RT-qPCR、免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay, IFA)技术检测SLM对PEDV复制周期的影响。结果表明PEDV感染Vero细胞后24 h病毒滴度最高(10^(7.7)·0.1 mL^(-1));SLM对Vero细胞的CC_(50)为7.698μmol·L^(-1),对PEDV的IC_(50)为1.617μmol·L^(-1);随着SLM浓度的增加,PEDV滴度、N蛋白和N基因mRNA的表达量逐渐下降;SLM抑制PEDV的复制阶段,对病毒的吸附、入侵和释放阶段无明显影响。该研究结果可以为进一步挖掘PEDV抑制药物提供新思路。

微载体高密度培养Vero细胞的研究

微载体是动物细胞高密度培养的有效手段。首先在硅化的方瓶中对Ｃｙｔｏｄｅｘ１、Ｃｙｔｏｄｅｘ３、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ、Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ、ＣＴ－１、ＣＴ－３、ＭＣ－１、ＣＴ－２８种国产和进口微载体进行了比较和筛选。确定以Ｂｉｏｓｉｌｏｎ作为Ｖｅｒｏ细胞高密度培养的首选微载体。用５００ｍｌ Ｗｈｅａｔｏｎ搅拌瓶探索影响Ｖｅｒｏ细胞高密度培养的条件。

PCIF1基因敲低细胞系的构建及其对猪流行性腹泻病毒复制影响的探究

【目的】旨在构建甲基转移酶——磷酸化C端结构域相互作用因子1(PCIF1)敲低细胞系,为探索PCIF1对猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制及其分子机制研究提供试验基础。【方法】利用RNA干扰(RNAi)技术构建PCIF1基因敲低(PCIF1-KD)细胞系。首先构建PCIF1基因特异性靶向干扰载体——pcDNA3.1-Double U6-mCherry-sh PCIF1,后经脂质体介导转染至非洲绿猴肾细胞(Vero-81),并通过遗传霉素筛选、富集PCIF1-KD重组细胞,以RT-qPCR和Western blotting检测PCIF1基因的敲低效果,并验证PEDV在获得的重组敲低细胞上的增殖能力。【结果】(1)重组干扰质粒经测序显示基因序列正确,证明成功构建PCIF1干扰质粒;(2)RT-qPCR和Western blotting试验结果表明,重组Vero-81细胞中PCIF1被显著敲低,获得了稳定的PCIF1-KD重组细胞系sh-△PCIF1-Vero-81;(3)PEDV感染验证发现PEDV在sh-△PCIF1-Vero-81细胞的增殖水平被显著抑制,且在感染后24~36 h病毒mRNA表达水平和蛋白表达水平均被进一步抑制。【结论】利用RNAi技术成功构建了一株稳定敲低PCIF1基因的细胞系sh-△PCIF1-Vero-81,PCIF1基因的沉默对PEDV的复制具有显著的抑制作用,且抑制程度随着时间增加而增加。研究结果可为进一步探究PCIF1对PEDV的影响或相互作用的分子机制提供有力工具和参考。

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。

应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究

对应用生物反应器系统和微载体培养Vero细胞生产PEDV进行了实验研究,通过分析和比较批培养及换液培养过程中细胞生长、代谢和病毒增殖的相互关系,发现PEDV随着细胞的生长而不断在胞内增殖和积累,72h后Vero细胞需经过一个短暂的停止生长阶段,再继续呈指数生长。反应器换液培养的单位培养基细胞产量比批培养提高了28%,比方瓶培养提高了138%,疫苗生产效率显著提高。当接种密度为1 23×105cells/ml时,换液培养至96h时获得了1 74×106cells/ml的高细胞密度,细胞扩增了14 3倍,且单位细胞的病毒产量并不低于静态培养。

用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液

目的 采用生物反应器微载体培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液。方法 用 5L生物反应器培养Vero细胞 ,培养至 4d时接种CTN株狂犬病毒 ,在培养全程对细胞生长所消耗的营养物质及代谢产物进行监测及分析。结果 培养 4d后细胞浓度可达 1 2× 10 7cells ml,培养 3周后的病毒液经ELISA检测A值可达 0 2 1～1 0 6。病毒滴度达 10 - 6 0 ～ 10 - 8 0 LogLD50 ml。病毒液可连续收获 5次。结论 用微载体系统培养Vero细胞可生产高滴度的狂犬病毒液。

Vero细胞的微载体培养——放大过程中的接种工艺

概述了用微载体系统培养贴壁细胞放大过程中的接种方法，研究了球转球的工艺条件，并建立了球转球的动力学模型。用此方法成功地在国产５０Ｌ生物反应器中培养Ｖｅｒｏ细胞，细胞密度达１．１×１０７ｃｅｌｓ／ｍＬ。

国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的接种反应及其免疫原性

目的观察国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的接种反应及其免疫原性。方法观察组200例和对照组50例暴露后,按照0、3、7、14、28d免疫程序,分别接种国产、进口冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)。观察组接种疫苗后,观察全身和局部反应情况。采用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测观察组和对照组接种后的血清中和抗体水平。结果观察组疫苗接种后,局部红肿、硬结、疼痛、瘙痒发生率分别1.4%、0.8%、17.1%和2.4%;全身反应发热、皮疹、头痛、疲劳乏力和其他反应发生率分别为1.2%、0.4%、2.4%、4.2%和0.3%,且在第7天完全消失。观察组与对照组疫苗首剂接种后7d,抗体阳转率分别为40.3%和37.0%,14d分别为95.5%和97.7%,差异无统计学意义;且首剂接种后45d,抗体阳转率均为100%。观察组和对照组疫苗首剂接种后7、14、45d,血清中和抗体GMT差异无统计学意义,14、45d血清中和抗体GMT均大于0.5IU/ml。结论国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)接种反应轻微,并具有良好的免疫原性。

流感病毒在Vero细胞上的适应性

目的研究WHO指定流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上的适应性,为用Vero细胞制备流感疫苗奠定基础。方法优化不同培养基、胰酶浓度、pH值等培养病毒的条件及收毒时间,将流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,并进行血凝效价检测及RT-PCR分析。结果在病毒维持液为F12+DMEM、pH为7.5、胰酶含量为1.5μg/ml、培养3 d收获病毒时,可获得较高的病毒血凝效价,连续传4代,病毒血凝效价降为0,RT-PCR检测结果为阴性。结论WHO推荐的流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,病毒血凝效价逐渐降低。

艰难梭菌A毒素诱导SMMC7721细胞和Vero细胞凋亡的比较研究(英文)

背景与目的:艰难梭菌是假膜性大肠炎及抗生素诱发性腹泻的主要致病菌之一,它产生的毒素具有不同的生物学活性。本实验拟研究艰难梭菌A毒素诱导人肝癌细胞株(SMMC7721)和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)凋亡的作用。方法:由脑心浸液对艰难梭菌VPI10463菌株培养产毒,经甲状腺球蛋白亲合层析和QSephrose层析提纯得到精制A毒素。对SMMC7721细胞的研究以Vero细胞为对照。抑制细胞增殖的检测采用MTT法;用荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞仪观察细胞形态和细胞周期的改变;采用琼脂糖凝胶电泳法观测DNA碎片。结果:不同浓度A毒素(0.293～4.690mg·L-1)明显抑制了SMMC7721及Vero细胞的增殖,并且呈时间和浓度依赖性;两种细胞与A毒素共同培养48h,荧光显微镜和透射电镜都观察到典型的凋亡形态变化;SMMC7721细胞与A毒素共同培养48h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯形条带。结论:A毒素明显诱导了两种细胞的凋亡;A毒素对SMMC7721细胞具有更强的诱导凋亡作用。

斑点杂交法测定Vero细胞DNA残留量的探针选择

目的:为精确检测以Vero细胞为基质的生物制品中宿主细胞残余DNA含量。方法:将提取的Vero细胞DNA分别用不同时间的超声波和 HindⅢ内切酶进行断链处理,电泳和序列分析并确定DNA片段长度,地高辛标记后制备成检测探针,测定已知的不同浓度的样品DNA和疫苗中DNA残留量。结果:HindⅢ内切酶处理断链后产生172 bp、344 bp、516 bp、688 bp不同长度的DNA,并选取172bp长度的DNA片断和超声波处理30 s的DNA长度为500～750 bp的DNA片断作为检测用探针。结论:两种方法处理的DNA探针检测DNA的灵敏度可达0.1 pg,重复性均较好,超声波处理的探针特异性优于酶切探针,并能成功的应用于疫苗产品中残余宿主细胞DNA的检测。

国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗接种反应及免疫效果

目的观察国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗接种反应及免疫效果。方法对93名观察对象采用0、3、7、14和28 d程序进行暴露后免疫,观察免后30 min的即时反应及72 h内的局部和全身副反应,并于第1针免疫后3、7、14和45 d采血,检测血清抗体水平。结果疫苗接种后均无异常反应,局部及全身一般反应率分别为5.8%和4.5%。免后7 d,血清抗体阳转率达22.58%,14 d达100%;免后7、14和45 d的GMT差异有显著意义;不同性别间免后14和45 d的GMT差异均无显著意义;不同年龄组间GMT14 d差异有显著意义,45 d差异无显著意义。结论国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗安全,免疫效果好。

应用动力学方法在线检测Vero细胞培养过程中的摄氧率

The oxygen uptake rate( OUR ) during the cultivation of Vero cells in 1.5L CelliGen bioreactor was on line determined using the dynamic method.The results showed that the cell growth and metabolic state during the exponential growth phase was lineally related to the OUR .This implies that the on line measurement of OUR can be used to promptly monitor the physiological state of cultured cells and to efficiently avoid contamination because of frequent sampling in the large scale cultivation of mammalian cells.

Vero细胞微载体悬浮培养制备人用狂犬病疫苗的研究

将“北京”及“CTN”两株中国分离的狂犬病病毒毒株适应于Vero细胞,病毒滴度可达10^(7.5)LD_(50)/ml。应用Veto细胞微载体反应器系统培养病毒,经丙内酯灭活,超滤浓缩制备的疫苗,其效力试验(NIH法)结果优于现行原代地鼠肾细胞培养疫苗。