HBV“a”决定簇突变及其对宫内传播影响的研究

目的探讨孕妇乙型肝炎病毒感染者“a”决定簇突变及其对HBV宫内传播的影响。方法收集2001年11月至2004年7月在太原市传染病医院妇产科住院的HBsAg阳性孕妇及其新生儿外周血,选取其中部分HBV DNA阳性标本进行nPCR产物直接测序,分析HBV“a”决定簇变异情况,比较HBV“a”决定簇突变组孕妇与未突变组孕妇HBV宫内感染率的差别。结果307例血清HB-sAg阳性孕妇中,HBeAg阳性119例,HBV DNA阳性126例。309例新生儿中,HBsAg、HBV DNA任一项阳性者69例,新生儿HBV宫内感染率为22.33%(69/309)。经过测序的49份标本(41份孕妇标本、8份婴儿标本)中,HBV基因型以C型、B型为主,D型只发现1份。49份标本(含1份假阳性)中共有7份标本(6份孕妇标本、1份婴儿标本)(9个位点)发生了HBV“a”决定簇突变,突变检出率为14.58%(7/48);突变组和未突变组的HBV宫内感染率分别为50.00%(3/6)、40.00%(14/35),差异无统计学意义(χc2=0.000 120,P>0.05);发生了HBV宫内感染的母儿之间,HBV序列同源性在98.67%以上,其中1例新生儿所携带HBV的aa145的密码子发生了同义突变(GGA→GGC)。结论对于感染HBV的孕妇而言,无论携带HBV“a”决定簇变异株还是野生株,未发现其新生儿发生HBV宫内感染的可能性有差别;宫内传播过程中存在S基因“a”决定簇变异株。

乙型肝炎病毒“a”决定簇突变对乙型肝炎疫苗保护效果的影响

目的研究乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）“a”决定簇热点突变对乙肝疫苗保护效果的影响。方法根据HBV基因保守序列设计PCR扩增引物,针对“a”决定簇突变设计简并探针,制备检测HBV“a”决定簇16种热点突变的基因芯片,并用克隆测序对芯片检测结果进行验证。基因芯片法检测47对乙肝疫苗阻断失败的母婴配对样本和323例阻断成功的母亲样本。结果克隆测序证明,基因芯片法具有特异性。应用该法检测发现,野生株（阳性率为78．66%）仍为主要流行株,依次为126A（11．27%）、145R（5．76%）、126S-1（5．28%）、126S-2（4．56%）、129H（1．20%）、144A（0．72%）、129R（0．24%）,但126A阳性率显著高于其他突变（P值均＜0．01）。阻断失败组母婴均感染的样本与阻断成功组的126A、126S-1、126S-2和145R检出率的差异无统计学意义。结论现有乙肝疫苗可阻断126A、126S和145R突变株的母婴传播,目前毋需研制针对126和145位点突变的新型乙肝疫苗,但需加强对突变株的流行病学监测。

武汉地区儿童乙型肝炎患者病毒S基因“a”决定簇变异的研究

目的研究武汉地区儿童乙型肝炎患者中乙型肝炎病毒(HBV)S基因变异株的分子流行病学特征。方法通过流行病学调查筛选出30例经乙型肝炎疫苗免疫的儿童乙型肝炎患者及30例未免疫儿童乙型肝炎患者,利用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV S基因片段,直接将PCR产物进行DNA序列测定。结果在60例儿童乙型肝炎患者中检测出55例adw血清亚型,其中8例HBV S基因发生氨基酸置换;直接测序检测的已免疫和未免疫儿童乙型肝炎患者S基因氨基酸置换频率分别为20.0%和6.7%,感染基因变异株的患儿发病年龄明显偏大,其疫苗免疫年限均较长。结论本地区流行的乙型肝炎病毒毒株主要为adw血清亚型;乙型肝炎疫苗具有免疫选择表面抗原基因变异株的作用;基因变异株病毒感染有随疫苗免疫年限延长而明显增加的趋势。

G145R突变后HBsAg“a”决定簇合成肽的免疫学特性分析

目的研究G145R突变后乙肝表面抗原(HBsAg)“a”决定簇合成肽的免疫学特性改变情况。方法首先合成2条短肽P1wt和P2145R,分别代表野毒株和G145R突变后HBsAg“a”决定簇合成肽。然后用β巯基乙醇(2ME)变性试验以及用乙肝疫苗标准品制备的小鼠多抗血清研究2条合成肽的空间构象以及抗原性异同。最后用等量合成肽免疫小鼠,用酶免疫法、竞争抑制试验和Westernblot试验等研究G145R突变后“a”决定簇合成肽的免疫原性改变。结果合成肽P1wt和P2145R用2ME温和变性后,PAGE结果表现为相对分子质量(Mr)为4×103左右的单一条带,而变性前2条合成肽均表现为Mr是从4×103到30×103的弥漫条带,主带位置在5×103和10×103,分别相当于二聚体和四聚体位置;用HBsAg的多克隆抗体(antiHBs)检测合成肽的抗原性,结果在固定抗原量的前提下,在抗体1∶32000稀释时仍可检测到P1wt的阳性结果,而当同一抗体稀释到1∶8000时,P2145R检测结果即为阴性。合成肽P2145R免疫小鼠产生的抗体与P1wt合成肽的反应滴度比与P2145R合成肽本身的反应低4～8倍。结论针对HBsAg“a”决定簇合成肽可自发形成一定的空间构象,G145R突变株的HBsAg“a”决定簇的抗原性和免疫原性与野毒株相比发生了明显改变,为正确评价G145R变异株的流行危害以及现行疫苗的保护效果提供了实验依据。

检测乙型肝炎病毒“a”决定簇热点突变基因芯片的制备和初步应用

目的为快速、高通量检测HBV“a”决定簇热点突变，制备基因芯片，并进行了初步应用。方法应用HBV基因保守序列设计PCR扩增引物，针对“a”决定簇突变设计简并探针，制备了检测126A、126S、144A、145R、145E、144A＋145R和144A＋145E突变的基因芯片。通过对质粒参考品或样本进行测定，以评价芯片的特异性、灵敏度、重复性和检测劣势株的能力，并对45例乙型肝炎患者的血清样本同时应用基因芯片和PCR产物直接测序法进行检测比较。结果所制备的基因芯片能特异性检测出质粒参考品，灵敏度为5×10^3拷贝／μl。同一样本检测10次，芯片内和芯片间变异系数均小于15％。当劣势株占HBV毒株10％以上时，基因芯片即可检出。芯片法测得45例样本中126A、126S-1和126S-2的阳性率（分别为46．67％、35．56％和24．44％）显著高于PCR产物直接测序法（分别为9．00％、4．44％和2．22％;P值分别为0．000、0．000和0．002），克隆测序验证了基因芯片法的特异性。结论基因芯片法可快速、有效地检测HBV特定位点突变株，为HBV突变的大规模筛查提供了方法。

表面抗原和抗体双阳性乙型肝炎患者HBVS基因“a”决定簇序列分析

目的分析HBsAg和抗-HBs双阳性乙型肝炎患者HBVS基因“a”决定簇序列特征。方法巢式PCR法扩增4例HBsAg和抗-HBs双阳性乙型肝炎患者HBVS基因，PCR扩增产物直接进行测序和克隆后测序，对获得的“a”决定簇序列进行比对分析。结果PCR扩增产物直接测序表明，4例患者HBV“a”决定簇低保守区各有1个氯基酸位点显示多态性。PCR产物克降后测序表明，病例1S基因“a”决定簇126位点（s126）氨基酸可为苏氨酸（T）、异亮氨酸（I）和丝氨酸（S），s134氦基酸可为苯丙氨酸（F）和丝氨酸（S）；病例2s126氨基酸可为丙氨酸（A）和苏氨酸（T）；病例3s126氨基酸可为异亮氨酸（I）和天冬酰胺（N）；病例4术发现多态性位点。结论HBVS基因“a”决定簇序列的多态性可能是引起乙型肝炎患者HBsAg和抗-HBs双阳性的原因之一。

乙型肝炎病毒“a”决定簇的变异对HBsAg定量的影响

目的为了明确乙型肝炎病毒"a"决定簇的变异对乙肝表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)定量的影响。方法收集广州血液中心无偿献血者的乙肝HBsAg阳性血清标本,共41例;采用时间分辨免疫荧光法对乙肝HBsAg进行定量,根据HBsAg定量结果将标本分为两组:低HBsAg组(0.05~100 IU/mL)和高HBsAg组(>100 IU/mL);提取乙型肝炎病毒DNA,采用高灵敏度巢式PCR扩增病毒DNA的S区,对S区"a"决定簇氨基酸序列进行比对。结果 41例乙肝HBsAg阳性标本中,以B基因型为主,占75.6%;C基因型占24.4%;对HBV病毒S区"a"决定簇氨基酸置换位点和置换率进行分析,没有发现低HBsAg组(0.05~100 IU/mL)和高HBsAg组(>100 IU/mL)存在特异性的氨基酸置换位点。低HBsAg组与高HBsAg组S区中"a"决定簇的氨基酸置换率相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论乙肝病毒"a"决定簇的变异并不是影响HBsAg定量的主要因素。

乙型肝炎病毒大S蛋白基因纵向研究方法及应用

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)大S蛋白基因纵向研究方法,并将其应用于疾病进程中HBV的准种动态研究.方法:以2例HBV感染者(对象A,男,38岁;对象B,女,22岁.对象A研究期间未经任何抗病毒治疗,B则1年持续接受ADV抗病毒药物治疗)体内不同时期的血清样本核酸提取物为模板,通过特异性扩增获取病毒大S蛋白基因序列并克隆测序,依据生物信息学方法对发生于序列结构不同区域的变异进行分析,利用比对数据对不同样本HBV准种予以描述与评价.结果:所得24条HBV大S蛋白基因序列中2条源于对象B样本的基因序列PreS2编码区存在30nt的缺失,其余22条序列大小均为1203bp;24条序列的HBV基因型均为C型.对象A大S蛋白基因序列分散值DA、DB、DC分别为:0.29、0.16、0.23,对象B则为0.80、2.30、1.82.来自对象A的全部10条HBV大S蛋白基因序列内部的"a"决定簇与参考基因完全一致;对象B的14条序列期初有2条(29%)期终有6条(86%)存在G145R突变,期终序列中有1条序列"a"决定簇内发现4个位点的突变.结论:人体内感染HBV以准种形式存在且可以用分散值DA、DB、DC对其进行描述,并应用于HBV准种动态的纵向研究.而抗病毒药物ADV的1年期治疗可使本例HBV准种分散性增高,可能增加本例耐药性突变出现的风险,同时增加本例"a"决定簇的变异出现.

HBV基因型分析及B/C型共感染的血清病毒种群分析

为了解HBV大三阳青年妇女的HBV基因型及体内病毒种群特征,从19～35岁青年妇女HBV感染者血清样本中筛选出24例HBV血清学标志物检测结果为大三阳的样本进行HBV基因分型检测,14例为B型,9例为C型,1例为B/C基因型共感染。对14例大S蛋白基因通过特异性扩增、序列克隆和测序确认的分型结果与分型检测一致。发现的1例B/C共感染样本来自阿德福韦酯抗病毒治疗35周患者,大S蛋白基因序列分析显示10条序列中4条为B型,准种分散值为2.8;其6条为C型,准种分散值为0.6。α决定簇分析该患者体内病毒种群包含3种血清型。病毒种群分析结果提示本地区青年妇女HBV感染的基因型主要为B型和C型,B/C基因型共感染患者体内HBV病毒种群呈复杂的多基因型分布,不同基因型内部以准种形式存在。

乙肝疫苗接种者和隐性HBV感染者血清中和效应的初步研究

目的:探讨乙肝疫苗接种者和隐性感染康复者血清体外阻断HBV感染作用的差异。方法:雅培ELISA定量测定乙肝疫苗接种应答者和隐性HBV感染康复者血清乙肝表面抗体,再调整到相同含量,分别和HBV预孵育1 h后感染Hep G2细胞,24 h后巢式PCR检测Hep G2细胞中HBV-DNA,评估其阻断效应。结果:同等浓度下,隐性感染康复者和乙肝疫苗接种者血清对野生株HBV感染阻断作用无差异,但乙肝疫苗接种者血清对变异株无阻断效应,隐性感染康复者对变异株仍有阻断作用,其作用明显弱于野生株。结论:隐性感染康复者血清对野生株和变异株HBV均有阻断作用,而乙肝疫苗接种者血清对变异株无阻断效应,提示新型乙肝疫苗应包含更多抗原成分如前S1/S2抗原,以对HBV变异株产生中和效应,应用多种成分的抗乙肝免疫球蛋白阻断肝移植后变异株HBV再感染十分重要。

乙型病毒性肝炎母婴传播阻断效果观察及病毒基因序列特征分析

目的观察乙型病毒性肝炎(乙肝)母婴传播阻断效果;探讨母婴传播阻断失败的病毒学因素。方法在四川和甘肃省5家医院招募439名慢性乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染孕妇及其新生儿,开展调查并采集血标本。对新生儿接种全程3剂次乙肝疫苗(Hepatitis B vaccine,HepB),检测母婴HBV血清学标志物和母亲病毒载量,扩增母亲HBV基因序列。结果研究地区乙肝母婴传播阻断成功率为93.39%,失败率为2.73%,无应答率为3.87%。母亲HBV基因型为C(43.01%)、B(37.63%)和D(19.35%);血清型为adr(37.63%)、adw(36.56%)、ayw(21.51%)、不确定型别(3.23%)和ayr(1.08%);阻断成功组和失败组的母亲a抗原决定簇突变率分别为30.59%、25.00%;阻断成功组与失败组的母亲HBV基因型构成、血清型构成以及a抗原决定簇突变率均无显著性差异(Fisher’s精确概率法,P>0.05)。结论研究地区乙肝母婴传播阻断成功率较高。HBV基因型、血清型差异以及a抗原决定簇突变不是影响母婴传播阻断失败的因素。