PCV-2、PCV-3、PCV-4三重PCR鉴别检测方法的建立与应用

为了建立一种快速鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪圆环病毒4型(PCV-4)的方法,试验设计合成PCV-2、PCV-3、PCV-4特异性鉴别检测引物,经一步法三重RT-PCR反应条件的优化,建立了PCV-2、PCV-3、PCV-4三重PCR鉴别检测方法。该方法对PCV-2、PCV-3、PCV-4、PCV-2/PCV-3/PCV-4可分别扩增出216、415、678 bp、216 bp/415 bp/678 bp的特异性条带,检测PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV均为阴性,对PCV-2、PCV-3、PCV-4的最低检测量分别为1.0×102、1.0×10^(3)、1.0×10^(3)拷贝/μL,与PCV-2、PCV-3、PCV-4单项PCR方法的符合率均为100%,应用该方法检测85份临床病料样品,PCV-2、PCV-3、PCV-4阳性感染率分别为21.17%、14.12%、4.71%。说明建立的PCV-2、PCV-3、PCV-4三重PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、准确性和临床适用性,为PCV-2、PCV-3、PCV-4的临床鉴别诊断提供一种简便、快速的分子生物学检测技术。

Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2)联合乳酸清除率评估脓毒症病情和预后的研究

目的分析脓毒症复苏过程中,中心静脉与动脉二氧化碳分压差和动脉静脉氧含量差的比值(Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2))联合乳酸清除率(LCR)与病情严重程度及预后的关系,探讨Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2)联合LCR对病情及预后的评估价值。方法92例脓毒症患者于入科和复苏6h后实施中心静脉和动脉血气分析,计算Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2)和LCR值。依据复苏6h后Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2)和LCR值分为3组,A组(Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2)<1.4和LCR≥10%)38例,B组(Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2)<1.4和LCR<10%)36例,C组(Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2)≥1.4)18例,比较3组患者一般情况、病情危重程度及预后指标,进行相关性分析,绘制ROC曲线评估预后。结果3组患者急性生理和慢性健康评估系统(APACHEⅡ)评分、入科及复苏6 h后心率、入科胆红素及肌酐水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。C组和B组患者序贯器官衰竭(SOFA)评分、入科及复苏6 h后去甲肾上腺素用量、机械通气使用率高于A组(P<0.05);C组与B组患者血小板水平低于A组(P<0.05)。C组28 d死亡率高于A组和B组(P<0.05)。复苏6 h后Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2)联合LCR与APACHEⅡ评分及SOFA评分呈正相关(P<0.05)。结论Pcv-aCO_(2)/Ca-vO_(2)联合LCR能够评估脓毒症病情及预后。

早期动态Pcv-aCO_(2)及Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)监测对感染性休克患者预后评估的前瞻性临床研究

目的探究早期中心静脉与动脉二氧化碳分压差(Pcv-aCO_(2))、中心静脉与动脉二氧化碳分压差和动脉与中心静脉氧含量差的比值(Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2))在感染性休克的预后评估中的价值。方法选择2018年10月至2020年12月间在宁夏医科大学总医院ICU收住的感染性休克患者90例,动态记录患者入ICU后第1、2、3、5天中心静脉和外周动脉血气分析数据。随访患者28 d预后,依据生存情况分为存活组(58例)与死亡组(32例)。采用Logistic回归对感染性休克患者预后影响因素进行分析。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析入院后24 h急性生理学和慢性健康状况评分系统II(APACHEⅡ)评分、乳酸和Pcv-aCO_(2)对患者预后的预测价值。结果感染性休克死亡组患者入ICU第2、3天的ScvO_(2)低于存活组(P<0.05)。第2、3天的Pcv-aCO_(2)高于存活组(P<0.05)。死亡组入ICU第1、2、3天的乳酸值均高于存活组(P均<0.05)。两组患者入ICU第5天ScvO_(2)、乳酸及Pcv-aCO_(2)的差异均无统计学意义(P均>0.05)。两组患者入ICU任何时相的Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)值差异均无统计学意义(P均>0.05)。以感染性休克患者的预后为因变量的Logistic回归分析,Pcv-aCO_(2)第3天(OR=1.153,95%CI:1.005~1.323)、Pcv-aCO_(2)第3天(OR=1.369,95%CI:1.030~1.819)以及APACHEⅡ评分(OR=1.565,95%CI:1.285~1.906)是影响感染性休克患者死亡的独立危险因素(P<0.05)。ROC曲线分析可得Pcv-aCO_(2)(第3天)联合APACHE II评分对于感染性休克病人的死亡的预测价值高于其单独的预测价值(AUC=0.727,P<0.001)。结论早期Pcv-aCO_(2)、血乳酸、ScVO_(2)较Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)更好反应感染性休克疾病严重程度和预后。持续升高的Pcv-aCO_(2)对感染性休克预后预测价值更大。

cGAS蛋白促进PCV-2茎环结构诱导cGAS-STING信号通路天然免疫反应研究

为了探索猪圆环病毒2型(PCV-2)DNA茎环结构是否可以激活环鸟苷酸腺苷酸合成酶(cGAS),以及是否诱导cGAS-STING信号通路天然免疫反应,试验将含有PCV-2茎环结构的单链DNA(SL-DNA)转染至PK15细胞中,通过Western-blot检测cGAS蛋白是否在PK15细胞中表达;将SL-DNA转染至过表达及敲除cGAS蛋白的PK15细胞中,通过实时荧光定量PCR检测细胞中cGAS、干扰素刺激基因(STING)、TANK结合激酶1(TBK1)、干扰素调节因子3(IRF3)、干扰素-β(IFN-β)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的表达水平。结果表明:SL-DNA转染后,PK15细胞中cGAS蛋白表达量上升;过表达cGAS蛋白的PK15细胞与PK15细胞相比,SL-DNA转染后cGAS、STING、TBK1、IRF3、IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α基因的相对表达量均极显著升高(P<0.01);敲除cGAS蛋白的PK15细胞与PK15细胞相比,SL-DNA转染后cGAS、STING、TBK1、IRF3、IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α基因的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。说明cGAS蛋白可以识别PCV-2的茎环结构,并且促进其诱导的cGAS-STING信号通路天然免疫反应。

某猪场致生长育肥猪腹泻的猪圆环病毒2型(PCV-2)病原学检测与病理组织学观察

某猪场80日龄左右的生长育肥猪群出现顽固性腹泻,腹泻粪便的形状复杂,为了查明病原,该试验采集病猪病料,提取病毒DNA和RT-PCR检测,并进行病理变化分析和病理组织学观察。结果表明:实时荧光定量PCR检测显示猪圆环病毒2型(PCV-2)强阳性,剖检发现脾脏有轻微梗死、淋巴结萎缩,病理组织学观察发现回肠肠粘膜上皮细胞显著增生,由单层变为多层,淋巴结和脾脏的淋巴细胞数量显著减少。试验说明PCV2是引起该猪场育肥猪腹泻的主要病原。

猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备

为了制备猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)Cap蛋白单克隆抗体,试验将Cap基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,将获得的重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)用IPTG进行诱导后表达重组蛋白,利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化;将纯化后的重组蛋白于皮下免疫Balb/c小鼠,免疫结束后测定免疫小鼠血清效价,当小鼠血清抗体效价达到1∶100000时进行细胞融合;采用有限稀释法进行亚克隆,筛选能够稳定分泌抗体且抗体效价高的阳性杂交瘤细胞株,鉴定杂交瘤细胞株抗体亚类,并选择1株抗体效价最高的细胞株再次注射到小鼠腹腔中(5×10^(5)个/只),取腹水采用亲和层析法对单克隆抗体进行纯化;采用间接ELISA方法测定单克隆抗体效价并检测其特异性,分别采用Western-blot和间接免疫荧光试验检测单克隆抗体的反应性。结果表明:PCR扩增得到大小为708 bp的Cap基因,经双酶切与测序验证后,成功构建重组表达质粒pET28a-Cap;重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)经诱导后表达的重组蛋白可与His标签抗体发生特异性反应,纯化后的重组蛋白在预期位置(31.7 ku)出现清晰的单一条带;共筛选出8株能够稳定分泌抗体且抗体效价高的阳性单克隆细胞株(1E5、2A9、3C6、4B3、5F7、6D11、7A2、8G1株),抗体亚类鉴定均为IgG1亚类。其中7A2株抗体效价最高,用于单克隆抗体的制备;间接ELISA方法证实7A2株单克隆抗体仅与PCV-2 Cap蛋白发生反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)不发生反应;Western-blot和间接免疫荧光试验均证实PCV-2 Cap蛋白可被7A2株单克隆抗体特异性识别。说明本试验成功制备出具有高纯度、强特异性、良好反应性的PCV-2 Cap蛋白单克隆抗体。

PCV-2和PCV-3 Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和鉴定

为了实现猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,本试验利用刚性连接肽连接PCV-2和PCV-3 Cap基因,构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV-2-3-Cap,双酶切验证正确后,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组杆粒。将重组杆粒转染SF9细胞(昆虫卵巢细胞),盲传3代,获得重组病毒。将重组病毒接种SF9细胞96 h后,通过细胞免疫荧光检测、Western blot和电镜观察对其进行验证,并利用噬斑法检测其效价。结果显示:成功构建重组质粒pFastBac-PCV-2-3-Cap,获得了重组杆粒rAcBacmid-PCV-2-3-Cap,并制备出重组杆状病毒rvAc-PCV-2-3-Cap。重组病毒感染SF9细胞后,目的蛋白成功表达,并可以形成病毒样颗粒,病毒效价为3.41×10^(6) PFU/mL。本试验成功在昆虫细胞-杆状病毒系统中共表达了PCV-2-3-Cap,为防治PCV-2和PCV-3混合感染的二联疫苗研究提供了数据支持。

Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)联合血气乳酸水平指导院前创伤性休克患者早期复苏的目标

目的探讨中心静脉-动脉血二氧化碳分压差(central venous-arterial carbondioxide difference,Pcv-aCO_(2))与动脉-中心静脉血氧含量差(arterial-central venous oxygen content difference,Ca-cvO_(2))的比值(Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2))联合血气乳酸水平作为院前创伤性休克患者早期复苏目标对预后的意义。方法回顾性分析常德市第一人民医院120急救中心2021年9月—2022年9月院前接诊的145例创伤性休克患者,其中男性73例,女性72例;年龄19~78岁,平均58.4岁;道路交通伤49例,高处坠落伤28例,击打伤17例,跌倒伤27例,其他24例。在120救护车上完成动脉置管和中心静脉置管术测定Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)值,同时采取床旁即时检验进行血气乳酸水平的监测。于休克复苏后1h(T1)按Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)和血气乳酸值结果分为4组:A组(n=45):Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)>1.8、乳酸水平>2mmol/L;B组(n=31):Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)>1.8、乳酸水平≤2mmol/L;C组(n=37):Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)≤1.8、乳酸水平>2mmol/L;D组(n=32):Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)≤1.8、乳酸水平≤2mmol/L。比较各组间液体治疗开始时间(T0)和液体复苏后1h(T1)心率、中心静脉压、平均动脉压、中心静脉血氧饱和度水平,入院后24h及第3天急性生理与慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation,APACHE)II和序贯器官衰竭评分(sequential organ failure assessment,SOFA)评分、住院时间、28d病死率。结果四组患者T0时心率、中心静脉压、平均动脉压、中心静脉血氧饱和度差异无统计学意义(P>0.05)。与T0相比,T1时的心率、中心静脉压、平均动脉压、中心静脉血氧饱和度比较差异有统计学意义(P<0.05)。D组在第3天的APACHE II(13.7±4.1)分和SOFA评分(5.2±2.1)分最低,住院时间最短(6.4±2.5)d,28d病死率(9.3%)最低,生存时间中位数最长,与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)。T1时的Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)和血气乳酸水平是28d病死率的独立预测因子。Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)联合血气乳酸水平的受试者工作特征(ROC)曲线下面积显著大于单独Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)或血气乳酸水平的ROC曲线下面积(P<0.05)。结论Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)联合血气乳酸水平可预测创伤性休克患者不良结局,并为院前评估创伤性休克早期复苏的充分性提供有用信息。

华东地区PMWS患病猪群PCV-2的检测及其基因特征

用 PCR方法 ,对江苏、上海、山东、江西、安徽和浙江等省市 6 5家猪场 99例断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)肺脏和淋巴结病料 ,进行了猪圆环病毒 - 2 (PCV- 2 )基因检测 ,发现其中 18家猪场 2 1例病料为 PCV- 2阳性。源自安徽和上海的 PCV- 2分离株经基因序列分析显示 ,2个分离株部分 ORF2 与国外分离毒株同源性为 92 %～99%。安徽分离株 AHHF6与韩国分离株 KSY- 1同源性为 99% ,而上海分离株 SHHT1与加拿大分离株 Imp.114 7同源性为 98%。上述结果表明 ,我国 PMWS患病猪群广泛存在 PCV- 2 ,不同地区 PCV- 2存在一定基因差异 。

云南地区部分猪场猪呼吸道疾病综合症(PRDC)患病猪群中PRRSV,PCV-2,CSFV,PRV混合感染调查

针对云南省不同地区不同季节猪呼吸道疾病综合征进行流行病学调查,根据其临床特征,在不同规模养殖场共采集1 164份血清样品,利用ELISA和RT-PCR方法检测其猪瘟抗原CSFV,猪繁殖与呼吸综合征抗原PRRSV,猪伪狂犬病PRV gE抗体及猪圆环病毒2型PCV-2特异抗体。结果表明:各季节和不同生长阶段猪群存在一种及两种以上的病毒混合感染,四重感染相对较少。从全年看单独感染占39.10%,PCV-2感染率最高,其次是PRV,PRRSV和CSFV;二重感染占26.13%,以PCV-2+PRV最常见,其次是PCV-2+PRRSV、PRV+PRRSV;三重感染占8.05%,PCV-2+PRRSV+PRV最常见;有四重感染出现,仅占1.57%。从季节来看,春季和夏季混合感染最高,分别为76.53%和60.74%,冬季和秋季的混合感染率分别为59.50%和53.55%。从年龄和性别看,育肥猪的混合感染率高于仔猪,分别为68.66%和61.11%,种公猪的感染率高于母猪,分别为70.00%和55.51%。说明4种病毒有单独感染或混合感染,推测其中PCV-2在混合感染中可能充当免疫抑制的角色,混合感染使PRDC症状更明显,死亡率增高。

猪传染性胸膜肺炎病料中PCV-2和PRRSV的PCR检测

应用PCR方法对从山东省不同地区采集的2 5 3份猪传染性胸膜肺炎肺脏和12 5份临床健康猪肺脏进行PCV_2和PRRSV的检测。结果显示,在传染性胸膜肺炎猪肺脏中,171份为PCV_2阳性,阳性率达6 7 5 % ;10 1份样品为PRRSV阳性,阳性率达4 0 % ;其中,6 8份样品同时检出PCV_2和PRRSV ,共感染阳性率达2 6 8%。而临床健康猪肺组织中,2 1份样品PCV_2检测结果为阳性,阳性率为16 8% ;12份样品PRRSV检测结果阳性,阳性率为9 6 % ,PCV_2和PRRSV共感染未检出。统计结果显示,传染性胸膜肺炎发病猪与临床健康猪PCV_2、PRRSV及PCV_2和PRRSV共感染的阳性率差异极显著,传染性胸膜肺炎发病猪的肺脏中PCV_2和PRRSV的检出率明显高于临床健康猪。上述检测结果提示。

PCV-2感染仔猪淋巴结中的病毒定位与细胞凋亡

【目的】了解PCV-2感染仔猪后,病毒在腹股沟淋巴结中的位置、凋亡细胞的类型及其两者之间的关系。【方法】选用9头32日龄PCV-2抗体阴性的普通断奶仔猪,随机分为3组,即对照组、PCV-2攻毒组(PCV-2组)、PCV-2攻毒后再用钥匙孔血蓝蛋白(KLH)刺激组(PCV-2+KLH组),每组3头。感染后32d采集腹股沟浅淋巴结制作石蜡切片。采用免疫组织化学方法对病毒进行定位,用末端标记法(TUNEL)进行细胞凋亡的定位测定,并用流式细胞法对细胞周期和细胞凋亡进行定量检测。【结果】PCV-2组和PCV-2+KLH组仔猪淋巴结的主要病变为皮质和副皮质区淋巴细胞严重缺失,上皮样巨噬细胞浸润,巨噬细胞胞浆内见有病毒包涵体,病毒主要存在淋巴小结的上皮样巨噬细胞中;PCV-2组和PCV-2+KLH组仔猪淋巴结中的淋巴细胞凋亡严重,且主要是淋巴小结内的淋巴细胞发生凋亡;流式细胞仪检测PCV-2组和PCV-2+KLH组仔猪淋巴结的细胞凋亡率分别为3.34%、4.88%,明显高于对照组0.41%的细胞凋亡率(P<0.05和P<0.01);表明细胞增殖活性的增殖指数(PI)分别是:0.17±0.01、0.12±0.01和0.12±0.04,3组间虽无统计学差异,但对照组高于2个实验组。【结论】PCV-2可通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡导致淋巴结中淋巴细胞的严重缺失,这可能是PCV-2感染引起仔猪免疫抑制的重要机理之一。

检测PRV野毒株、PCV-2及PPV多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。

PRRSV和PCV-2双重PCR检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株(ATCCVR-2332)的ORF7保守序列和猪圆环病毒2型(PCV-2)(AF381175)的ORF2基因保守序列,设计合成了两对特异性引物。用这两对引物,通过优化的PCR条件,对PRRSV阳性毒株反转录后的cDNA模板和PCV-2毒株的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到两条与试验设计相符的432bp(PRRSV)和630bp(PCV-2)特异性条带,建立了同时检测PRRSV和PCV-2的双重PCR方法。并用此方法对在安徽省不同地区所采集的72头份病猪的淋巴结、肺、肝、脾、肾等组织进行检测,证明建立的PCR方法可用于临床诊断。

PCV-2、PPV和PRV多重PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立可用于临床同时检测PCV-2、PPV和PRV 3种DNA病毒感染的多重PCR方法。【方法】根据GenBank中收录的PCV-2、PPV和PRV的基因组序列,选择3种病毒的特异性保守区设计3对引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重PCR方法,对该方法的特异性、敏感性、稳定性进行检测,并将其用于临床病料的检测。【结果】多重PCR方法中,当引物浓度均为1.0μmol/L,退火温度为57.2℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从PCV-2、PPV、PRV病毒DNA中分别扩增出长度为353,265和198bp的目的片段,从3种病毒DNA的混合物中也可扩增出上述目的片段,而其他对照组的扩增结果均呈阴性。敏感性试验结果表明,建立的多重PCR方法对PCV-2、PPV和PRV的最低检测量分别为26.88,25.34和24.9pg/μL。在不同时间对每份样品重复检测3次,结果一致,表明该方法具有良好的可重复性。临床应用结果表明,39份疑似病料中,PCV-2、PPV和PRV的阳性率分别为53.84%,17.95%和5.13%,PCV-2与PPV混合感染的阳性率为15.38%,PCV-2、PPV和PRV混合感染的阳性率为2.57%。【结论】建立的多重PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可以有效检测PCV-2、PPV和PRV的混合感染。

PCV-2 ORF2和PRRSV ORF5基因的扩增与双基因真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因序列,分别设计一对引物,应用PCR和RT-PCR扩增出PCV-2 ORF2基因和PRRSV ORF5基因。将PCR产物ORF2经NheⅠ/EcoRⅠ双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2,RT-PCR产物ORF5经NotⅠ/XbaⅠ双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建重组质粒pIRES-ORF2/ORF5。对此质粒中的插入片段,进行PCR RT-PCR及双酶切鉴定,同时对插入序列进行测序分析,表明SD1株ORF2与国内多种毒株的同源性为99%,pIRES-ORF2ORF5转移载体ORF5基因的核苷酸推导氨基酸与北美洲原型(VR-2332株)氨基酸同源性为99%。此重组表达载体的成功构建,为进一步研究PCV-2 ORF2及PRRSV ORF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二联核酸疫苗奠定了基础。

PCV-2陕西株ORF2基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆猪圆环病毒2型陕西分离株(PCV-2SX株)ORF2基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的PCV-2ORF2基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,应用PCR方法扩增PCV-2SX株ORF2全长基因,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。然后,将ORF2基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。【结果】扩增到了702bp的PCV-2ORF2全长基因。序列分析结果表明,PCV-2SX株ORF2基因与广西分离株(EF675237,ChinaGX)和巴西分离株(DQ861802,am21)的核苷酸序列同源性均达98.0%,氨基酸序列同源性均达98.3%,与其他毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在89.9%～97.9%和88.5%～98.0%。SDS-PAGE可检测到分子质量约为48ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。Western-blotting分析表明,重组蛋白可被PCV-2阳性血清所识别。【结论】成功克隆了PCV-2SX株ORF2基因,并进行了原核表达。

猪血清中PCV-2全基因组的克隆与序列分析

为研究从猪血清中分离的猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）与从发病猪组织中分离的PCV-2之间的差异、了解贵州地区PCV-2遗传变异情况、丰富贵州PCV-2全基因组序列库,试验采用来自贵州省毕节市金沙县、遵义市绥阳县、毕节市黔西县和贵阳市修文县的PCV-2抗体阳性猪血清,通过PCR扩增及通过T克隆获得了4株PCV-2全基因,分别命名为GZ-JS2015、GZSY2016、GZ-QX2014和GZ-XW2014,并进行测序;将测序结果与笔者收集的38株PCV-2的核苷酸序列进行比对分析。结果表明：在病毒血症期间猪血清中分离的PCV-2与从发病猪组织中分离的PCV-2并无太大差异;笔者收集的血清中贵州省为10株,其中8株为PCV-2b型、2株为PCV-2a型,说明在贵州地区流行的主要是PCV-2b型;来自贵州省同一地区的2株PCV-2处于不同的进化树分支上,与省外的PCV-2分离株亲缘关系较近,提示在贵州省流行的部分PCV-2可能由引种时流入。

Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)联合ScvO_(2)检测对脓毒症患者预后的预测价值

目的探讨中心静脉-动脉二氧化碳分压差/氧含量差比值(Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2))联合中心静脉血氧饱和度(ScvO_(2))检测对脓毒症患者预后的预测价值。方法选择2016年6月至2019年6月该院收治的脓毒症患者进行回顾性分析,根据离开医院时的结局分为存活组及死亡组,比较两组患者一般资料、实验室指标、Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)及ScvO_(2)的差异,采用COX回归模型分析预后的影响因素,采用Kaplan-Meier曲线分析不同Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)及ScvO_(2)患者预后的差异,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)及ScvO_(2)对预后的预测价值;采用Logistic回归模型分析两项指标联合检测对脓毒症预后的预测价值。结果与存活组比较,死亡组患者的Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)、肌酐、尿素氮、降钙素原、急性生理和慢性健康状态评分Ⅱ(APACHEⅡ评分)明显增加(P<0.05),ScvO_(2)、清蛋白水平明显降低(P<0.05);经COX回归模型分析,Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)、ScvO_(2)、APACHEⅡ评分是脓毒症患者预后的影响因素;经Kaplan-Meier曲线分析,不同Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)及ScvO_(2)患者的预后差异有统计学意义(P<0.05);经ROC曲线分析,Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)及ScvO_(2)对脓毒症患者的预后具有预测价值;在Logistic回归模型中生成Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)联合ScvO_(2)预测脓毒症患者预后的新指标,该指标对脓毒症患者预后的预测价值优于单一指标。结论Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)及ScvO_(2)是脓毒症患者预后的影响因素,Pcv-aCO_(2)/Ca-cvO_(2)联合ScvO_(2)用于预测脓毒症患者预后具有更优的灵敏度和特异度。

含CpG基序的PCV-2的ORF2基因真核表达载体的构建

通过PCR扩增得到PCV-2的ORF2基因,将其插入到了真核表达载体pVAX1中,构建了重组质粒pVAX1-ORF2。作为免疫佐剂,一段150 bp的人工合成CpG-ODN被插入到了pVAX1-OFR2的骨架结构中,构建了含有CpG-ODN的表达ORF2编码蛋白的重组质粒pVAX1-ORF2-CpG。