钙调神经磷酸酶对钙化细胞Ⅰ型三磷酸肌醇受体表达的影响

目的探讨大鼠血管平滑肌细胞钙化过程中钙调神经磷酸酶对Ⅰ型三磷酸肌醇受体蛋白和mRNA表达的影响。方法大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞经传代培养后随机分为对照组、钙化组和环孢素A组,采用磷酸二氢钠诱导大鼠动脉血管平滑肌细胞钙化。应用免疫印迹法及实时荧光定量RT-PCR法测定钙调神经磷酸酶B亚基、Ⅰ型三磷酸肌醇受体的表达变化,同时测定Ca2+浓度及碱性磷酸酶、钙调神经磷酸酶活性。结果与对照组比较,钙化组钙调神经磷酸酶B亚基、Ⅰ型三磷酸肌醇受体蛋白和mRNA表达显著增加(P<0.01);与钙化组比较,环孢素A组钙调神经磷酸酶B亚基、Ⅰ型三磷酸肌醇受体蛋白和mRNA表达显著降低(P<0.01)。钙化组Ca2+浓度、钙调神经磷酸酶活性、碱性磷酸酶活性较对照组显著增高(P<0.01);环孢素A组碱性磷酸酶活性、Ca2+浓度较钙化组显著增加(P<0.05或P<0.01),钙调神经磷酸酶活性较钙化组显著降低(P<0.01)。结论钙调神经磷酸酶能够增强钙化细胞中Ⅰ型三磷酸肌醇受体mRNA和蛋白的表达。

血管平滑肌细胞增殖过程中钙调神经磷酸酶对三磷酸肌醇受体Ⅰ型表达的调节

目的研究血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖过程中钙调神经磷酸酶(CaN)对三磷酸肌醇受体Ⅰ型(IP3RⅠ)表达的调节。方法植块法分离培养VSMCs,比色法(MTT法)测定VSMCs的增殖,荧光染色法测定VSMCs的活性,RT-PCR检测IP3RⅠ型mRNA转录水平,免疫印迹法(Westernblot)测定IP3RⅠ型蛋白质翻译水平。结果苯肾上腺素(PE)组VSMCs吸光度显著高于对照组(P<0·05),环孢素A(CsA)组和CsA+PE组VSMCs吸光度显著低于对照组(P<0·05)。PE组活细胞百分数与对照组无显著差异(P>0·05),CsA组和CsA+PE组活细胞百分数显著低于对照组(P<0·05)。PE组IP3RⅠ型mRNA表达水平显著高于对照组(P<0·05),CsA组和CsA+PE组mRNA水平显著低于对照组(P<0·05)。PE组IP3RⅠ型蛋白质表达水平显著高于对照组(P<0·05),CsA组和CsA+PE组蛋白质表达水平显著低于对照组(P<0·05)。结论CaN调节VSMCs增殖与活性,并且在转录水平和翻译水平调节IP3RⅠ的表达。

一氧化氮/环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶对血管平滑肌细胞三磷酸肌醇受体Ⅰ型表达及细胞内游离钙的调节

目的证明一氧化氮/环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶对血管平滑肌细胞三磷酸肌醇受体Ⅰ型的表达以及细胞内游离钙水平的调节。方法比色法测定血管平滑肌细胞增殖,激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度,逆转录聚合酶链反应以及免疫印迹法测定三磷酸肌醇受体Ⅰ型的表达水平。结果一氧化氮供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶选择性环磷酸鸟苷类似物Sp8-pCPT-cGMP抑制血管平滑肌细胞增殖,但环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶拮抗剂Rp-8-pCPT-cGMP促进血管平滑肌细胞增殖。且S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和Sp-8-pCPT-cGMPS可以进一步抑制经维拉帕米预处理后的血管平滑肌细胞增殖。维拉帕米抑制苯肾上腺素刺激的细胞内游离钙离子浓度升高,这一抑制作用能够被S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和Sp-8-pCPT-cGMP进一步加强,但可被Rp-8-pCPT-cGMP减轻。三磷酸肌醇受体Ⅰ型mRNA转录与蛋白质表达被S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和Sp-8-pCPT-cGMP降低,但被Rp-8-pCPT-cGMP增加。结论一氧化氮/环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶在转录水平和翻译水平抑制血管平滑肌细胞三磷酸肌醇受体Ⅰ型的表达,进而参与对细胞内游离钙离子浓度的调节。

蛋白激酶C对肾小球前小动脉平滑肌细胞Ⅰ型IP_3受体表达影响

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)引起的肾小球前小动脉平滑肌细胞(RASMC)内Ⅰ型三磷酸肌醇(IP_3)受体mRNA过度表达的影响。方法:通过对RASMC的分离、培养,应用核酸杂交技术分别检测在TNF-α和PKC抑制剂、TNF-α和PKA抑制剂及PKC激动剂作用下,RASMC内Ⅰ型IP_3受体mRNA的表达情况。结果:TNF-α促进RASMC内Ⅰ型IP_3受体mRNA表达增加;PKC抑制剂明显抑制TNF-α诱导的Ⅰ型IP_3受体mRNA过度表达的作用(14814.0±2029.9,11334.0±1104.9,P<0.05);PKC激动剂能增强RASMC内Ⅰ型IP_3受体mRNA表达(22554.5±2625.2,28128.0±3698.6,P<0.05);PKA抑制剂-H_(89)不影响TNF-α诱导Ⅰ型IP_3受体mRNA的表达。结论:TNF-α影响细胞内储备Ca^(2+)释放信息传递系统可能通过激活PKC作用于Ⅰ型IP_3受体基因,使Ⅰ型IP_3受体mRNA合成增加,导致Ⅰ型IP_3受体蛋白过度表达,参与促进RASMC内储备Ca^(2+)大量释放至胞质,引起肾小球前小动脉平滑肌收缩,使肾血流量减少,肾小球滤过率下降,导致肾功能异常。

TNFα通过TNFR1/PKCα和TNFR2信号通路诱导人肾小球系膜细胞IP_3R1的表达

目的:探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)对人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)IP3R1蛋白和mRNA表达的影响及PKC和肿瘤坏死因子受体(tumornecrosis factor receptor,TNFR)在此信号通路中的作用,以期为肝肾综合征(hepatorenal syndrome,HRS)肾小球滤过率下降的发生机制和防治思路提供理论依据.方法:用实时定量PCR和免疫印记法检测IP3R1mRNA和蛋白表达的情况,并分别用PMA耗竭内源性蛋白激酶C(endogenous protein kinase C,PKC),PKCα特异性抑制剂Safingol和PKCδ特异性抑制剂Rottlerin及HA-DN-PKCα质粒转染干预上述诱导实验.同时,用免疫印记法检测TNFα对PKCα和p-PKCα的表达的影响.此外,免疫印记法检测TNFR对PKCα的活化及IP3R1蛋白表达的影响.结果:TNFα作用HMCs后,IP3R1蛋白和mRNA表达均明显增加.PMA、PKCα抑制剂Safingol,HA-DN-PKCα质粒转染均能明显阻断TNFα诱导的IP3R1蛋白的上调,而P K Cδ抑制剂Rottlerin无明显阻断作用.TNFα刺激HMCs,各不同时间组总PKCα蛋白表达无明显差异,而TNFα刺激8h p-PKCα蛋白表达明显增加.TNFR1抗体+TNFα组和TNFR2抗体+TNFα组,IP3R1蛋白表达均有明显的不同程度的下降.TNFR1抗体+TNFα组p-PKCα蛋白表达明显下降,而TNFR2抗体+TNFα组,p-PKCα蛋白表达无明显变化.结论:TNFα能上调HMCs中IP3R1蛋白及IP3R1mRNA的表达.活化的PKCα可能在TNFα上调IP3R1的表达中起重要作用.TNFα可能通过TNFR1/PKCα途径及TNFR2途径上调IP3R1的表达.

ITPR1基因新发变异所致脊髓小脑性共济失调29型患儿1例的诊断

目的分析1例ITPR1基因新发变异所致脊髓小脑性共济失调29型(SCA29)患儿的临床特征和遗传学特点。方法选取2020年7月1日于河北省人民医院就诊的1例SCA29患儿为研究对象。对患儿进行高通量测序,通过Sanger测序对候选变异进行家系验证。结果高通量测序显示患儿携带ITPR1基因c.800C>T(p.T267M)杂合变异,胎儿及父母Sanger测序均未检测到此变异,此新发变异既往国内未见报道,且位于ITPR1基因的变异热点区域,结合患儿的临床表型,诊断其为SCA29。结论ITPR1基因c.800C>T(p.T267M)位点杂合变异可能是本例SCA29患儿的重要致病原因。

转录因子 Sp1在人肾小球系膜细胞 IP3 R1表达中的作用

目的探讨转录因子Sp1在肿瘤坏死因子（ TNF-α）上调人肾小球系膜细胞（ HMCs ） IP3R1表达中的作用，进一步阐明肝肾综合征（ HRS）肾小球滤过率（ GFR）下降的分子机制。方法用实时定量PCR和免疫印迹检测TNF-α刺激HMCs后，IP3R1 mRNA、IP3R1蛋白及Sp1蛋白表达的情况，重组质粒PGL3-IP3R1 promoter瞬时转染HMCs，应用荧光素酶报告基因检测TNF-α对IP3R1启动子活性的影响；应用Sp1和DNA结合抑制剂光辉霉素（ Mithramycin A ）及Sp1-siRNA质粒瞬时转染预处理HMCs后，检测IP3R1蛋白表达的变化。此外，免疫印迹法检测肿瘤坏死因子受体（ TNFR）对Sp1的活化及IP3R1蛋白表达的影响。结果 TNF-α作用HMCs后，IP3R1 mRNA、IP3R1蛋白和Sp1蛋白表达均明显增加，TNF-α显著增强IP3R1基因启动子的活性，Mithramycin A呈剂量依赖性阻断TNF-α诱导IP3R1蛋白表达上调，Sp1-siRNA预处理HMCs后，IP3R1蛋白表达明显下降。 TNFR1抗体＋TNF-α组和TNFR2抗体＋TNF-α组，IP3R1蛋白表达均有不同程度的下降。 TNFR1抗体＋TNF-α组Sp1蛋白表达明显下降，而TNFR2抗体＋TNF-α组，Sp1蛋白表达无明显变化。结论 TNF-α能上调人系膜细胞IP3R1的表达，TNF-α可能通过TNFR1/Sp1上调IP3R1的表达。

PKCα在人系膜细胞IP_3Rl蛋白表达中的调控作用

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)对人肾小球系膜细胞(HMCs)IP3R1蛋白和mRNA表达的影响及PKC在此信号通路中的作用,以期为肝肾综合征(HRS)肾小球滤过虑下降的发生机制和防治思路提供理论依据。方法用实时定量PCR和免疫印记法检测IP3Rl mRNA和蛋白表达的情况,并分别用PMA耗竭内源性蛋白激酶C(PKC),PKCα特异性抑制剂Safingol和PKCδ特异性抑制剂Rottlerin及HA-DN-PKCα质粒转染干预上述诱导实验。同时,用免疫印记法检测TNFα对PKCα和p-PKCα表达的影响。用非放射性测活检测TNFα对PKCα的活化及抑制剂对PKCα活化的影响。结果 TNFα作用HMCs后,IP3R1蛋白和mRNA表达均明显增加。PMA,PKCα抑制剂Safin-gol,HA-DN-PKCα质粒转染均能明显阻断TNFα诱导的IP3R1蛋白的上调,而PKCδ抑制剂Rottlerin无明显阻断作用。TNFα刺激HMCs,各不同时间组总PKCα蛋白表达无明显差异,而TNFα刺激8h p-PKCα蛋白表达明显增加。此外,非放射性测活表明TNFα活化PKCα,Safingol可阻断PKCα的活化。结论 TNFα能上调HMCs中IP3R1蛋白及IP3RlmRNA的表达。活化的PKCα在TNFα上调IP3Rl的表达中起重要作用。