抗人Ⅰ型干扰素受体亚基1人源化单克隆抗体的制备和鉴定

Ⅰ型干扰素在系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用,采用抗体阻断其信号转导通路具有潜在的治疗作用。本研究以人Ⅰ型干扰素受体亚基1(IFNAR1)重组蛋白为抗原免疫新西兰白兔,采用B细胞克隆技术筛选兔抗人IFNAR1单克隆抗体,经过人源化改造获得QX006N。体外研究结果显示,QX006N能特异性地结合人IFNAR1,亲和力约108 pmol/L,可阻断Ⅰ型干扰素信号通路及其介导的生物学效应。本研究为开发靶向干预Ⅰ型干扰素信号途径用于治疗SLE的抗体药物提供了坚实的基础。

牛Ⅰ型干扰素受体α链与其配体结合活性的鉴定

为研究牛Ⅰ型干扰素受体α链(IFNAR1)与其配体结合的生物学性质,本研究采用RT-PCR方法从感染水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的犊牛原代肾细胞中扩增得到IFNAR1基因,然后构建了表达BoIFNAR1胞外区多肽(BoIFNAR1-EC)的原核表达载体pET30a-BoIFNAR1-EC,在RosettaTM(DE3)pLysS宿主菌中表达出重组蛋白rBoIFNAR1-EC,并以纯化后的rBoIFNAR1-EC作为免疫原制备兔抗牛IFNAR1的多克隆抗体,随后鉴定BoIFNAR1与其配体的结合活性。结果表明,试验成功克隆得到1 685bp的牛IFNAR1基因,编码560个氨基酸,由24个氨基酸组成的信号肽、414个氨基酸组成的胞外区、23个氨基酸组成的跨膜区及99个氨基酸组成的胞内区组成,与其他物种IFNAR1氨基酸序列同源性为63%~91%,在进化上具有高度保守性,其与羊的亲缘关系最近。随后构建了含牛IFNAR1胞外区基因的重组表达载体,并诱导表达了重组牛IFNAR1胞外区蛋白rBoIFNAR1-EC,其在大肠杆菌中几乎全部为可溶性表达,经纯化透析后作为免疫原制备了兔抗牛IFNAR1的特异性抗体,抗体效价高达1∶204 800。配体结合试验表明,牛IFNAR1重组蛋白可与牛IFN-αA和IFN-ε结合,其多克隆抗体可阻断牛IFN-αA和IFN-ε与细胞表面的IFNAR1特异性结合,进而阻断牛IFN-αA和IFN-ε的抗病毒信号传导。

病毒靶向人Ⅰ型干扰素受体1的负调控机制

人Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)的诱生和应答在机体抗病毒固有免疫中发挥重要作用。但病毒多可逃逸宿主此类抗病毒免疫,导致感染和致病。Ⅰ型干扰素受体(interferon alpha receptor,IFNAR)是识别及结合IFN-I的一种跨细胞膜蛋白受体,其IFNAR1亚型在干扰素发挥抗病毒效应的启动阶段发挥关键作用;本文从IFNAR1蛋白质的表达、降解及其功能等方面,概述病毒以IFNAR1为靶点负调控IFN-I的抗病毒机制,以期为该领域基础研究和临床抗病毒策略提供有益的参考依据。

猪肾上皮细胞Ⅰ型干扰素受体1敲除对伪狂犬病毒复制的影响

目的探讨Ⅰ型干扰素受体1 (IFNAR1)对伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。方法以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK15)敲除IFNAR1基因的稳定细胞系。运用细胞活力检测、荧光观察、流式细胞术检测、滴度测定、Real-time PCR等技术进行IFNAR1功能验证。结果随着PRV感染时间延长,敲除IFNAR1基因可以显著促进PRV-TK mRNA的转录,PRV-gE蛋白的翻译以及子代病毒的毒力。结论IFNAR1在抑制PRV增殖中发挥重要作用。

Ⅰ型干扰素受体1启动子的多态性以及其对慢性HBV感染的影响

背景与目的：暴露于HBV导致不同的临床过程，部分地与宿主遗传变异有关。我们的目的是要研究Ⅰ型干扰素受体1（IFNAR1）启动子的多态性以及它们对慢性HBV感染的影响。

慢性乙型肝炎患者IFN-α/β受体和细胞因子表达与干扰素疗效间的关系

目的:检测慢性乙型肝炎(CHB)患者α干扰素治疗前后血清中细胞因子及受体水平及治疗前外周血单个核细胞(PBMCs)中Ⅰ型干扰素受体,并观察α干扰素疗效,以探讨α干扰素与病毒复制消长的关系。方法:采用酶标(ELISA)法检测22例CHB患者治疗前后血清中细胞因子及受体(IL6,IL2,TNFα,IL8,sIL2R)水平,并用链霉亲和素生物素酶复合物法(SABC)检测α干扰素治疗前患者PBMCs中IFNα/β受体表达。结果:治疗应答者血清IL6,sIL2R水平下降明显,而IL2水平则明显上升。22例CHB患者中,干扰素治疗完全应答者7例,其中IFNα/β受体高表达者6例,占85.71%;干扰素治疗无应答者11者,其中IFNα/β受体高表达者3例,占27.27%。两者间比较差异有显著性意义(P<0.05)。部分应答者4例,IFNα/β受体高表达者2例。结论:干扰素治疗CHB患者其疗效与细胞膜上IFNα/β受体表达水平和血清细胞因子的调节密切相关。应重视对IFNα/β受体及血清中细胞因子及受体水平的监测,以提高α干扰素抗乙肝病毒的疗效。

人I型干扰素受体亚基稳定表达真核细胞的筛选及鉴定

目的:筛选及鉴定人I型干扰素受体亚基(IFNAR1)稳定表达真核细胞。方法:体外扩增IFNAR1基因片段,将双酶切后扩增片段和pc DNA3.1(+)连接构建重组质粒pc DNA3.1-IFNAR1,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。重组质粒pc DNA3.1-IFNAR1转染肝癌细胞系Hep G2,新霉素筛选挑取阳性克隆细胞,蛋白质印迹试验(Western blotting)分析阳性细胞IFNAR1表达水平。结果:经双酶切和测序验证pc DNA3.1-IFNAR1重组质粒构建成功。pc DNA3.1-IFNAR1转染Hep G2经新霉素筛选后获得稳定表达细胞系,蛋白质印迹试验(Western blotting)证实这些细胞具有较好蛋白表达水平。结论:体外成功构建不同IFNAR1稳定表达水平的Hep G2细胞。

柯里拉京对小鼠单纯疱疹病毒性脑炎Toll样受体3-干扰素诱导链接蛋白通路的调控机制研究

目的:通过柯里拉京(Cor)干预单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)小鼠模型,阐明柯里拉京对Toll样受体3(TLR3)信号通路的调控机制。方法:通过颅内注射单纯疱疹病毒1型(HSV1)建立单纯疱疹病毒性脑炎小鼠模型,每天定时灌胃1次等体积的柯里拉京或生理盐水,在第5天断头处死小鼠,取出右侧颞叶病变脑组织进行苏木精-伊红(HE)染色,在显微镜下观察小鼠脑组织病理改变,通过定时定量PCR检测TLR3及其下游信号分子TLR结构域的干扰素诱导链接蛋白(TRIF)mRNA的表达情况,Western blot检测TLR3、TRIF蛋白表达情况,ELISA法检测炎性组织细胞内干扰素α(IFN-α)的分泌情况。结果:HSE小鼠模型中TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α的分泌均高于正常对照组(P<0.01);柯里拉京干预可有效缓解动物脑组织的病理变化,且TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α的分泌均低于正常对照组(P<0.01)。结论:柯里拉京能明显抑制小鼠小胶质细胞内TLR3通路达到缓解单纯疱疹病毒1型引起的脑组织的损伤。

阻断清道夫受体AⅠ对巨噬细胞源泡沫细胞基质金属蛋白酶及其组织抑制剂表达的影响

为探讨巨噬细胞源泡沫细胞基质金属蛋白酶及其组织抑制剂的表达及活性与清道夫受体AⅠ的关系 ,应用油红O染色、高效液相色谱法检测巨噬细胞的泡沫化 ,逆转录聚合酶链反应检测细胞清道夫受体AⅠ的表达 ,Westernblot、明胶酶谱法观测巨噬细胞泡沫化后阻断清道夫受体AⅠ对THP 1细胞基质金属蛋白酶 2、基质金属蛋白酶 9、组织型基质金属蛋白酶抑制剂 1及组织型基质金属蛋白酶抑制剂 2表达的影响。结果发现 ,THP 1细胞在佛波酯处理 2 4h后有清道夫受体AⅠ的表达 ,清道夫受体AⅠ反义寡核苷酸及其抗体能显著降低基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶 9的蛋白表达和活性 ,并增加组织型基质金属蛋白酶抑制剂 1和组织型基质金属蛋白酶抑制剂 2的表达。结果提示 ,阻断清道夫受体AⅠ有助于基质金属蛋白酶与组织型基质金属蛋白酶抑制剂的平衡维持 。

人可溶性白介素1受体编码区基因的体外扩增

目的 研究可溶性白介素 1受体 (sIL 1R)在哺乳动物真核细胞中的表达 ,为牙周病的基因治疗奠定基础。方法 从人牙龈成纤维细胞中提取总RNA ,设计特异性引物 ,上游引物 (P1)为 :5′ggccggtaccATGAAAGTGTTACTCAGACTTATT 3′ ;下游引物 (P2 )为 :5′gagctcgagttaCTTTCTGGAAATTAGTGACTGG 3′。采用RT PCR技术体外扩增人IL 1R(Ⅰ )胞外部分成熟肽编码区基因。结果 抽提得到的人牙龈成纤维细胞总RNA经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳得到 2 8s、18s两条清晰条带 ;RT PCR产物经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳 ,在 1kbmarker条带处出现特异性条带。结论 通过RT PCR技术 ,成功地扩增得到人sIL 1R(Ⅰ )编码区基因 ,大小约 1kb 。

泛癌分析揭示SREK1在低级别胶质瘤中促进CD274表达

目的剪接调节谷氨酸和富赖氨酸的蛋白质1(SREK1)在多种肿瘤中的泛癌分析,揭示SREK1在泛癌中的作用。方法利用在线数据库GEPIA 2、TIMER 2.0、TISIDB和cBioPortal分析SREK1表达对肿瘤患者预后的影响、在低级别胶质瘤(LGG)肿瘤组织中的表达、遗传变异的特征及其表达对肿瘤组织中免疫细胞的浸润和免疫—肿瘤靶基因的相关性分析。结果LGG肿瘤组织中,SREK1表达与记忆B细胞、活化的CD4+T细胞、Th2细胞、中性粒细胞、NKT细胞以及单核细胞和CD56dimNK细胞的浸润存在相关性(P均<0.05)。SREK1与免疫—肿瘤靶基因如信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)、Ⅰ型干扰素受体1(IFNAR1)、核受体亚家族3C组成员1(NR3C1)和表皮生长因子受体(EGFR)、表面抗原分化簇274(CD274)等表达在LGG中均呈正相关(P均<0.05)。结论SREK1是LGG患者的危险因子之一,可能通过促进CD274的表达来加剧LGG的进展。

基于CRISPR/Cas9系统Ⅰ型干扰素受体亚单位1基因敲除的Caco-2细胞系的构建

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1(interferon alpha/beta receptor subunit 1,IFNAR1)基因,构建IFNAR1基因敲除Caco-2细胞系。方法利用CRISPR/Cas9技术设计特异性识别IFNAR1基因外显子区的sgRNA(single guide RNA)序列,构建LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒,慢病毒包装后感染Caco-2细胞,嘌呤霉素抗性筛选,有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western blot法验证IFNAR1基因敲除情况;通过加入外源性IFNβ检测IFNAR1基因敲除细胞CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和干扰素刺激基因20(interferon-stimulatd gene 20,ISG20)mRNA水平。结果质粒LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA测序结果显示插入位置均位于BsmBⅠ酶切黏性末端。共获得2株IFNAR1基因敲除单克隆细胞株,测序结果显示Caco-2-IFNAR1-KO1的IFNAR1第6个外显子发生5 bp缺失,Caco-2-IFNAR1-KO2的第7个外显子发生18 bp缺失,同时有1 bp增加。与野生型Caco-2细胞相比,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞IFNAR1蛋白未见表达。相比于0 ng/mL IFNβ,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为0.566和1.268,P>0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为1.522和1.733,P>0.05)均无明显升高;与野生型Caco-2细胞相比,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为6.763和6.777,P<0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为5.664和5.653,P<0.05)均显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功获得了IFNAR1基因敲除的Caco-2细胞株,该细胞系依赖Ⅰ型IFN受体(interferon alpha/beta receptor,IFNAR)激活的下游分子被明显抑制,为进一步探讨病毒感染Caco-2细胞后的天然免疫反应及复制包装机制提供了有力的工具。

Ⅰ型干扰素受体1单核苷酸多态性与结核病易感性的关联性

目的探究Ⅰ型干扰素受体1(typeⅠinterferon receptor 1, IFNAR1)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与结核病易感性的关系。方法应用病例-对照研究方法,以深圳市第三人民医院1 533例活动性结核病患者(包括1 432例肺结核、101例肺外结核)作为病例组,1 445例健康人群作为对照组。运用MassARRAY飞行时间质谱技术,通过检测Ⅰ型干扰素(interferon, IFN)基因rs72552343、rs2834191、rs1012334、rs17875752、rs2843710、rs1041868位点基因型,分析两组间SNP等位基因频率差异,同时进一步比较肺结核与肺外结核病患者rs72552343TCC/Del位点等位基因频率差异。结果用MassARRAY飞行时间质谱技术可以有效地检测6个SNP位点基因型。在6个SNP位点中,发现仅rs72552343 TCC/Del位点等位基因频率在活动性结核组和对照组中差异有统计学意义(P<0.05),结核病患者rs72552343 TCC/Del位点TCC等位基因频率显著增高(OR=0.46;95%CI=0.31~0.70;P=0.0002),其他5个SNP等位基因频率在两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。另外,发现肺外结核病患者rs72552343 TCC/Del位点TCC等位基因的频率与肺结核病患者差异无统计学意义(OR=0.88;95%CI=0.20~3.74;P=0.86)。结论 IFN基因rs72552343 TCC/Del位点SNP与结核易感性相关,其TCC等位基因为结核易感基因,但携带TCC等位基因的个体患活动性肺结核与肺外结核的风险一致。

慢性丙型肝炎患者外周血Toll样受体3和7与Ⅰ型干扰素基因表达的研究

目的 观察慢性丙型肝炎（CHC）患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）中Toll样受体3（Toll like receptor 3,TLR3）和7（TLR7）,以及Ⅰ型干扰素α（Interferonα,IFN-α）和β（IFN-β） mRNA的表达,探寻CHC治疗的新方法.方法 选择2013年9月至2014年5月武汉大学人民医院收治住院的30例CHC患者,并选择同期体检的健康人群30名作为健康对照组.采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肝功能指标;用实时荧光定量PCR检测TLR3、TLR7、IFN-α和IFN-β mRNA表达,并用2-△△Ct方法计算相对表达量.两样本均数比较采用t检验,TLR mRNA与IFNmRNA表达、肝功能指标及HCV RNA载量之间的相关性采用Pearson相关性分析.结果 健康对照组的基因表达量为1,CHC组TLR3、TLR7、IFN-α和IFN-β mRNA的相对表达量分别为0.086、0.633、0.145和0.423,两组间比较差异均有统计学意义（=4.25,2.39,2.37和2.80,P值均＜0.01）.Pearson相关性分析显示,TLR3和TLR7 mRNA表达量与IFN-β mRNA表达量呈正相关性（r=0.381和0.487,P值均＜0.05）,但与IFN-α mRNA表达量、HCV RNA载量、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平无相关性（P值均＞0.05）.结论 CHC患者TLR3、TLR7mRNA以及IFN-α、IFN-β mRNA表达均降低,且TLR3和TLR7mRNA表达与IFN-β mRNA呈正相关,提示可通过提高TLR受体的表达为CHC的治疗提供新的方法.

E3泛素连接酶Nrdp1优先促进TLR介导的Ⅰ型干扰素产生

E3泛素连接酶对于固有免疫和获得性免疫非常重要。我们发现E3泛素连接酶Nrdp1通过抑制MyD88依赖的转录因子NF-κB和AP-1的活性并促进激酶TBK1和转录因子IRF3的活性,进而抑制Toll样受体诱发的促炎症细胞因子的产生,但增加了巨噬细胞的干扰素-β分泌。Nrdp1可以直接结合并将MyD88和TBK1多泛素化,进而导致MyD88的降解和TBK1的活化。敲低Nrdp1的表达可抑制MyD88的降解以及TBK1和IRF3的活化。Nrdp1转基因小鼠表现出对脂多糖诱导内毒素休克和对疱疹口炎病毒感染的抗性。上述结果提示,Nrdp1同时具有接头蛋白和E3泛素连接酶的功能,可通过不同的方式调节TLR反应。

人I型干扰素受体亚基表达对IFN-α抑制HBV复制水平的影响

目的探讨人I型干扰素受体亚基(IFNAR1)不同表达水平对IFN-α抑制HBV复制的影响。方法扩增在前期构建的IFNAR1不同表达水平稳定Hep G2细胞(R1/H1、R1/H2、R1/H3株和对照细胞PS1、PGFP细胞),分别以瞬时转染HBV表达质粒pUC19-1.24HBV和对照质粒,培养24h后加入IFN-α,48h后收集细胞采用Southern blot检测HBVD-NA,荧光定量PCR检测细胞和上清HBVDNA水平。结果 Southern blot检测提示IFN-α干预后HBV复制水平在R1/H1和R1/H2细胞及R1/H3株中IFN-α抑制细胞内核壳颗粒HBVDNA活性显著高于PS1和PGFP细胞;荧光定量PCR结果提示R1/H3细胞中细胞和上清HBVDNA水平较R1/H1、R1/H2细胞系无显著下降。结论 IFNAR1蛋白表达水平不同可能导致IFN-α抑制HBV复制效应的差异。

MxA-88G/T和IFN-γ+874A/T位点多态性对地方流行区HBV感染自然转归的影响

目的:探讨常见影响乙型肝炎病毒(HBV)感染自然转归的宿主遗传因素在地方性流行区的作用。方法:收集华南地区100例HBV自限感染者(抗-HBs和抗-HBc均阳性)和340例慢性HBV感染者的外周全血,采用竞争分化聚合酶链反应技术为基础的方法进行MxA-88G/T和IFN-γ+874A/T基因分型。结果:MxA-88G/T的基因型在慢性HBV感染者和自限性感染者中的分布差异有高度显著性;与慢性感染患者相比,自限性感染者有较低的GG基因型(41.0%vs52.9%,P=0.036)和较高的TT基因型(16.0%vs2.4%,P=0.000)。然而,IFN-γ+874A/T的基因型在两组患者中的分布差异并无显著性;在慢性感染者和自限性感染者中,AA基因型分布率为65.0%vs72.8%(P=0.139),TT基因型为2.0%vs1.2%(P=0.894)。结论:常见影响HBV感染自然转归的宿主基因多态性在地方性流行区的作用有所改变,值得同类研究高度注意。

NEAT1与系统性红斑狼疮发病的相关研究

本研究探讨长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中的表达情况及其意义。收集诊断明确的42例SLE患者和54例正常对照者外周血,采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测NEAT1的表达并分析其与SLE临床特征和干扰素(IFN)积分的相关性。与正常对照相比,NEAT1在SIE患者外周血中异常高表达,并且NEAT1的表达水平与SLE疾病活动指数(SLEDAI)、SLE肾脏损伤活动指数(Renal-SLEDAI)、干扰索积分显著正相关,SLE并蛋白尿患者NEAT1表达量显著高于SLE非蛋白尿患者,SLE并低补体患者NEAT1表达量显著高于SLE并正常补体患者,这就为SLE发病机制的研究提示了新的方向。

基于报告基因的抗IFNR1单抗生物学活性测定方法的建立

目的:建立抗Ⅰ型干扰素受体亚基1单抗(抗IFNR1单抗)的生物学活性检测方法。方法:利用HEK293-ISRE-Luc细胞系,通过荧光素酶检测系统(ONE-Glo?Luciferase Assay System),进行抗IFNR1单抗生物学活性检测,并对该方法进行精密度、准确度、专属性的验证。结果:抗IFNR1单抗在该方法中均存在量效关系,利用四参数方程拟合成4S型曲线,50%、75%、100%、125%及150%的加标样品相对效价(n=3)分别为(49.58±2.90)%(RSD=5.8%)、(76.27±5.12)%(RSD=6.7%)、(99.84±4.21)%(RSD=4.2%)、(123.08±2.58)%(RSD=2.1%)、(158.69±4.72)%(RSD=3.0%),RSD均小于10%;加样回收率分别为(99.16±5.81)%、(101.69±6.82)%、(99.84±4.21)%、(98.47±2.06)%和(105.80±3.14)%,RSD均小于10%;专属性良好。结论:建立的抗IFNR1单抗生物学活性检测方法,可作为抗IFNR1单抗生物学活性的常规检测方法。