顺式和反式-AT型聚酮合酶研究进展及应用

聚酮类化合物因广泛应用于医药等方面而被大家所熟知,Ⅰ型聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)在催化聚酮类化合物的生物合成中起着重要的作用。根据不同的酰基转移酶(Acyltransferase,AT)结构域,Ⅰ型 PKS 可分为顺式-AT (cis-Acyltransferase,cis-AT)型 PKS 和反式-AT (trans-Acyltransferase,trans-AT)型PKS,目前cis-AT型PKS研究得比较透彻,trans-AT型PKS相关研究成为当今热点。本文总结了cis-AT型PKS和trans-AT型PKS的联系与区别、工程进展、相关应用以及目前存在的问题,以期为了解cis-AT型PKS和trans-AT型PKS在聚酮化合物合成中的作用提供参考。

PKSI-AT结构域及在组合生物合成研究中的应用

Ⅰ型聚酮合酶(PKSI)的模块型分子结构组织方式非常适合于组合生物合成研究.结构域和模块通过二级组织方式构成了PKSI的催化单元,其它结构多肽则作为"支架".在"支架"上对结构域和模块两个水平进行突变、替换、插入、缺失等基因操作形成重组PKS,可以理性设计并获得复杂多样的新活性或高活性的聚酮化合物.利用PKSI进行组合生物合成以期获得新聚酮化合物的研究迄今已有约25年,但是目前仍不能够对PKS进行完美的理性设计,快速合成目标活性的新聚酮化合物.PKS中的酰基转移酶结构域的研究在PKS的组合生物合成研究中一直发挥着重要作用.本文结合本课题组的研究基础,对AT结构域的结构、功能及在组合生物合成研究中的最新研究成果作以分析总结.

聚酮合酶大蛋白的表达和纯化方法的建立

CalA3是钙霉素生物合成途径中的大型聚酮合酶,生物信息学分析表明CalA3隶属I型聚酮合酶(PKS-I)。本研究通过构建、体外表达,建立了CalA3的纯化流程,获得了高纯度、稳定的巨大蛋白。通过无缝克隆方法,从柯斯质粒p16F9上扩增calA3基因片段,C端引入6His Tag,成功构建到表达质粒pET-28a(+)上,得到结果质粒pET-CalA3cH;通过探索不同的表达宿主、共表达分子伴侣和培养基的优化,获得最佳表达条件:在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中通过LBBS培养基与pGro7共表达,获得了该蛋白的最优可溶性高表达;通过Ni2+亲和层析、Heparin、离子交换和凝胶过滤层析多步纯化手段,对CalA3进行了有效分离纯化,获得了高纯度和稳定的蛋白;通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析法测定了CalA3的表观分子量,并推测该蛋白为二聚体;凝胶迁移实验证明CalA3具有DNA结合能力。本研究探索了体外表达和纯化大型聚酮合酶CalA3蛋白的方法,成功获得了大蛋白在大肠杆菌中的异源表达和纯化,表征了CalA3的二聚体分子量为360 kD,并初步确定了CalA3具有体外结合DNA的能力,暗示其在钙霉素生物合成中具有转录调控功能。本研究为进一步研究CalA3的功能提供了理论依据。

卡伍尔氏链霉菌NA4生物合成巴弗洛霉素前体甲氧基丙二酰ACP来源的研究

巴弗洛霉素(bafilomycin)是一类由Ⅰ型聚酮合成酶装配合成的具有十六元大环内酯骨架的化合物,是研发农药和医药的良好母体。深海来源的卡伍尔氏链霉菌(Streptomyces cavourensis) NA4能产生巴弗洛霉素,而较低的发酵产量限制了巴弗洛霉素产业化应用。明确前体来源是理性构建高产菌株的基础,为了确定卡伍尔氏链霉菌NA4中合成巴弗洛霉素重要前体甲氧基丙二酰ACP的来源,构建了甲氧基丙二酰ACP生物合成部分基因bafB-E缺失突变株。实时荧光定量PCR分析发现野生株NA4中bafB mRNA表达水平随培养时间延长而不断增强,突变株则检测不到bafB mRNA的表达,显示ΔbafB-E突变株构建成功。进一步HPLC-UV分析结果显示,相比野生株NA4,ΔbafB-E突变株不再产生巴弗洛霉素。提示野生株NA4中bafB-F编码的合成途径是巴弗洛霉素装配前体甲氧基丙二酰ACP的唯一来源。将为通过强化前体供应策略理性构建巴弗洛霉素高产菌株提供参考。

多烯大环内酯类抗生素生物合成和组合生物合成

多烯大环内酯类(Polyene macrolides)化合物是1大类抗真菌抗生素,广泛应用于医药、食品工业和农业之中。该类化合物的生物合成是典型的Ⅰ型聚酮合酶(Polyketide Synthetase,PKS)途径,其模块型的特殊结构和合成机制赋予了其非凡的可塑性。本文就7种已报道的多烯大环内酯类化合物,包括制霉菌素、两性霉素、匹马霉素、杀念菌素/FR-008、龟裂霉素、NPP和四霉素的生物合成进行了分析比较,并综述了近年来多烯大环内酯类化合物的组合生物合成研究进展。