Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞

目的建立利用Ⅰ型胶原酶消化组织块体外培养人牙髓细胞方法.方法通过组织块Ⅰ型胶原酶消化法进行人牙髓细胞体外培养,免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源,进行细胞传代,酶组织化学法对体外复层生长的人牙髓细胞爬片进行碱性磷酸酶组织化学染色,并检测其矿化能力.结果采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养的原代牙髓细胞,在第15～20 d出现汇合,第4～6代牙髓细胞在连续培养后具有复层生长特性,并具有显著的碱性磷酸酶活性,阳性染色强弱部位呈区域性分布,连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节.结论Ⅰ型胶原酶消化组织块法可以很好地进行人牙髓细胞体外培养,可以用酶组织化学法研究牙髓细胞的生物学特性.

改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对成骨细胞增殖效果的比较研究

目的 比较改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对SD大鼠颞下颌关节髁突软骨下骨成骨细胞的增殖效果.方法 取10只出生1 -3dSD乳鼠颞下颌关节髁突软骨下骨,将骨片平分成2份,分别采用改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消法培养颞下颌关节髁突成骨细胞,并标记为Ⅰ组和Ⅱ组,通过细胞形态学观察、HE染色、ALP染色鉴定成骨细胞.取第4代成骨细胞进行细胞计数、MTT生长曲线及流式细胞仪周期分析,比较2种原代培养方法对成骨细胞增殖能力的异同.结果 （1）Ⅰ组和Ⅱ组培养的细胞经鉴定均为成骨细胞; （2） Ⅱ组成骨细胞总量约为Ⅰ组细胞总量的1.5倍; （3） Ⅱ组成骨细胞MTT生长曲线较Ⅰ组细胞提前2d进入对数生长期及达到生长高峰; （4）2组细胞在达到第4代时,细胞周期含量差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消化法均适用于颞下颌关节软骨下骨成骨细胞的培养,但改良Ⅰ型胶原酶消化法可以更快速有效地获得大量成骨细胞.

Ⅰ型胶原酶对人牙周膜胶原蛋白构象影响的拉曼光谱研究

目的通过激光共聚焦拉曼光谱仪进行人牙周膜结构测定,探讨Ⅰ型胶原酶处理后牙周膜胶原纤维中胶原蛋白二级结构的变化。方法将人前磨牙牙根自颈部至根尖切分为3片2 mm薄片,选择根中部牙周膜样本进行实验。将牙周膜样本分为酶处理组和对照组,酶处理组样本在室温下进行10 mg/mLⅠ型胶原酶溶液浸泡2 h。两组样本依次进行拉曼光谱仪测定,获得拉曼光谱并进行峰值分析。结果获得正常和胶原酶处理后人牙周膜样本的拉曼光谱图以及胶原蛋白二级结构谱图。人牙周膜拉曼光谱在酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅲ带、CH2、酪氨酸和苯丙氨酸都出现特征峰。胶原蛋白的二级结构的主链构象主要由酰胺Ⅰ带(1 600~1 700 cm-1)和酰胺Ⅲ带(1 200~1 350 cm-1)表征,特征峰位在胶原酶处理后出现偏移。对照组牙周膜酰胺Ⅲ带的高斯拟合胶原蛋白各二级结构相对含量百分比分别为:无规卷曲29%,α-螺旋61%,β-回折2%,β-折叠8%。胶原酶处理后酰胺Ⅲ带中α-螺旋的含量下降,无规卷曲、β-回折和β-折叠的含量上升。结论Ⅰ型胶原酶使牙周膜胶原蛋白降解,改变了蛋白的二级结构,可能与牙周膜生物力学性能下降有关。

人脂肪干细胞的提取和鉴定

背景:脂肪干细胞是存在于脂肪中的全能干细胞,具备自我更新能力与多向分化潜能,遗传背景相当稳定,体内植入后免疫排斥少,是一种比较理想的种子细胞。目的:提取人大网膜脂肪干细胞,并进行成脂和成骨分化能力鉴定。方法:收集手术患者大网膜的脂肪组织,经Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心后进行原代培养,观察细胞生长状态;用细胞计数法绘制人脂肪干细胞增殖曲线,计算处于对数生长期的倍增时间;用相应的定向诱导液诱导人脂肪干细胞向脂肪细胞及骨细胞方向分化,并用油红O染色、茜素红染色进行鉴定。结果与结论:从手术患者大网膜脂肪组织中成功分离人脂肪干细胞,贴壁生长的人脂肪干细胞为长梭形,形态类似成纤维细胞。第3代人脂肪干细胞生长曲线呈S形,对数生长期人脂肪干细胞的倍增时间为45.90 h。人脂肪干细胞经成脂、成骨定向诱导分化2,3周后,油红O染色显示细胞内有大小不等的橘红色脂肪滴,茜素红染色可见着橘红色的典型钙化结节,提示所培养的脂肪干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞系分化的能力。

原代人宫颈癌细胞的培养方法

背景:在体外分离、培养宫颈癌上皮细胞,从细胞水平及分子水平研究肿瘤病因及治疗的基础,是宫颈癌组织工程研究的最基本环节。目的:探讨适用于组织工程宫颈癌研究的人宫颈癌原代细胞培养方法以及传代后细胞形态变化、增殖的特性。方法:0.25%胰蛋白酶和2%Ⅰ型胶原酶联合消化法体外培养宫颈癌原代细胞,荧光倒置显微镜下观察肿瘤细胞形态、体外生长情况,免疫组化法检测体外培养宫颈癌细胞表面标记物CK17和肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达。结果与结论:采用胰蛋白酶与Ⅰ型胶原酶联合消化法体外分离培养人宫颈癌细胞,该法相对简单且重复性较好,所得到的原代细胞纯度较高。经体外传代培养的宫颈癌细胞仍可保持稳定的细胞表型。宫颈癌细胞表面标记物CK17阳性表达,证实细胞为上皮源性,肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达阳性提示所培养细胞具有肿瘤细胞恶性增殖的特性。

两种软骨终板细胞体外培养方法效果的比较研究

目的比较原代椎间盘软骨终板细胞实验室培养中Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶消化效率的差异。方法提取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织,将其剪碎并随机分成2等份,标记为Ⅰ型胶原组和Ⅱ胶原型组;用0.25%的胰蛋白酶预消化后,分别用0.02%Ⅰ型胶原酶和0.02%Ⅱ型胶原酶在37℃消化3次,每次1 h;将3次消化所得的细胞悬液混匀后离心,获取细胞并进行培养与传代;对两组软骨终板细胞分别进行细胞计数、细胞形态学观察和细胞增殖情况检测等处理,比较两组软骨终板细胞数目、形态及增殖情况的差异。结果 1)细胞计数:Ⅰ型胶原组细胞3次细胞计数结果分别为5.75×104个/m L、5.50×104个/m L、6.25×104个/m L,获得软骨终板数目(5.83±0.31)×104个/m L;Ⅱ胶原型组细胞3次细胞计数结果分别为8.75×104个/m L、9.50×104个/m L、8.25×104个/m L,获得软骨终板数目(8.83±0.51)×104个/m L,Ⅰ型胶原组细胞总量明显少于Ⅱ胶原型组;2)细胞形态:两组软骨终板细胞多呈多角形,胞核大而圆,形态无明显差异。3)细胞增殖:Ⅰ型胶原组细胞MTT读数OD值为(0.561±0.003),Ⅱ胶原型组细胞MTT读数OD值为(0.562±0.002),组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论Ⅱ型胶原酶较Ⅰ型胶原酶更适用于原代椎间盘软骨终板细胞的分离培养。

人卵巢颗粒细胞分离培养方法的改进

背景:建立分离培养颗粒细胞快速有效的方法也是提高体外受精-胚胎移植成功率关键的一步。虽然目前文献中有较多关于人卵巢颗粒细胞分离方法的报道,但在细胞数量、纯度及后续生长等方面不尽人意。目的:建立有效的分离提纯、体外培养人卵巢黄素化颗粒细胞的方法。方法:收集体外受精-胚胎移植取卵时的卵泡液,用裂解法、沉淀法、密度梯度离心法分离,Ⅰ型胶原酶或透明质酸酶消化颗粒细胞黏液团并接种在培养皿中进行培养,培养液中加入或不加自体卵泡液。结果与结论:用裂解法得到的颗粒细胞数较沉淀法和密度梯度离心法得到的细胞数多(P>0.05,P<0.05);3种方法提取的颗粒细胞活性比较无明显差异;培养24 h后沉淀法贴壁细胞数最多(P<0.05),而密度梯度离心法贴壁细胞数最少(P<0.05);透明质酸酶消化颗粒细胞较Ⅰ型胶原酶耗时少且消化彻底;加入自体卵泡液能够促进颗粒细胞生长和存活。结果证实,沉淀法提取颗粒细胞虽然耗时长,但培养的细胞存活率高、培养后收获的细胞数多;透明质酸酶较Ⅰ型胶原酶更适合消化颗粒细胞黏液团;在培养液中加入自体卵泡液更有益于颗粒细胞生长。

加载miRNA-21壳聚糖基纳米粒对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的观察壳聚糖/三聚磷酸钠/透明质酸/miR-21纳米粒(CTH/miR-21 NPs)对牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的作用。方法采用离子交联法制备CTH/miR-21 NPs,与0.2%的明胶溶液混合后涂覆细胞培养板底部,制备miR-21功能化的反向转染培养板。通过扫描电镜观察纳米粒的分布及交联效果。分析CTH/miR-21 NPs的粒径、电位及形态。原代培养PDLSCs,并对其成骨、成脂分化潜能及细胞表面标记物进行鉴定。将PDLSCs接种于含CTH/miR-21 NPs涂层的培养板,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察CTH/miR-21 NPs反向转染PDLSCs的效率,并通过RT-PCR观察其成骨相关基因的表达情况。结果 CTH/miR-21 NPs粒径由147.3 nm增加至288.5 nm,Zeta电位由44.5 mV降至21.7 mV,CTH/miR-21 NPs被明胶交联于培养板底部,呈球形。PDLSCs可以成功地被CTH/miR-21 NPs反向转染,且300、450 pmol/孔组RUNT相关转录因子2(RUNX2)、骨桥素(OPN)、Ⅰ型胶原酶(COLⅠ)及骨钙素(OCN)表达水平高于0 pmol/孔组(P<0.05,P<0.01)。结论 CTH/miR-21 NPs可以高效反向转染PDLSCs并促进成骨相关基因的表达,可以为基因转染技术应用于牙周组织再生提供新的思路。

大鼠尾椎髓核干细胞的分离与分化能力

目的:分离大鼠尾椎髓核干细胞(NPSCs),并检测其多向分化的能力。方法:取4周龄大鼠10只,解剖显微镜下分离尾椎C1～C5的髓核,经Ⅰ型胶原酶消化获得髓核原代细胞(NPCs),按照200个/cm^2的细胞密度接种于10 cm培养皿,获取细胞集落,观察集落细胞的形态特点,并与NPCs比较。并将获得的细胞集落按照50个/cm^2的密度进行单克隆形成能力检测。进行成骨、成脂肪及成软骨方向分化诱导,分别用茜素红、油红O及番红染色鉴定。结果:髓核组织呈半透明的胶质状,质软。按照200个/cm^2的细胞密度接种培养髓核细胞,在培养3～5 d可见细胞集落形成,且集落内细胞的形态呈梭形,无"空泡"。而NPCs呈不规则性状,且细胞内含有较多"空泡"。获得的细胞集落仍然具有单克隆形成能力。且体外能进行成骨、成脂肪及成软骨方向分化诱导。结论:大鼠髓核组织中存在干细胞,按照200个/cm^2的密度能够分离出NPSCs,且具有成骨、成脂肪及成软骨等多向分化的能力。

三种方法制作人脱细胞真皮基质的生物学特性比较

1材料与方法 1．1主要试剂 鼠抗人Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体，鼠抗人波形蛋白抗体，鼠抗人结蛋白抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；dispaseⅡ、Ⅰ型胶原酶、噻唑蓝（MTT）购白美国Sigma公司。

养心康片调节自噬对慢性心力衰竭小鼠心肌纤维化的影响

目的:研究养心康片对心衰后小鼠心肌纤维化的影响,探讨其作用机制。方法:采用胸主动脉缩窄法(TAC)建立小鼠慢性心衰模型,建模成功后随机分为假手术组,模型组,3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(15 mg·kg^-1),养心康片高、中、低剂量组(1 170,585,390 mg·kg^-1),假手术组给予等体积蒸馏水灌胃。30 d后行心脏超声检查,收集血流动力学参数;通过心脏石蜡切片,马松(Masson)染色观察心肌细胞形态学变化及心肌纤维化程度;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测微管相关蛋白轻链3(LC3),酵母ATG6同源物(Beclin-1),溶酶体膜蛋白(LAMP)心肌自噬蛋白,Ⅰ型胶原酶(CollagenⅠ),Ⅲ型胶原酶(CollagenⅢ),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)心肌纤维化标志性蛋白表达情况。结果:与假手术组比较,模型组小鼠左心射血分数(LVEF),短轴缩短分数(FS)明显降低(P<0. 05),左心室舒张末期内径(LVDd),左心室收缩末期内径(LVDs)明显增大(P<0. 05),心肌纤维化程度显著加重(P<0. 01),α-SMA,CollagenⅠ,CollagenⅢ心肌纤维化标志性蛋白,LAMP,LC3,Beclin-1自噬蛋白表达均明显升高(P<0. 05);与模型组比较,3-MA组,养心康高、中剂量组心脏超声各项指标均显著改善(P<0. 05),心肌纤维化程度明显改善(P<0. 01),α-SMA,CollagenⅠ,CollagenⅢ,LAMP,LC3,Beclin-1表达明显降低(P<0. 05),低剂量组心功能、心肌纤维化及各项蛋白表达差异不明显。结论:养心康片可通过下调自噬减缓慢性心力衰竭小鼠心肌纤维化,改善心功能。