人细胞内Ⅰ型血小板激活因子乙酰水解酶重组蛋白的构建、纯化及酶活性研究

目的构建人细胞内Ⅰ型血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)重组蛋白并加以纯化,利用不同底物研究酶活性。方法细胞内Ⅰ型PAF-AHβ亚基基因进行PCR扩增,目的基因经纯化、连接载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞构建重组蛋白,提取质粒行琼脂糖凝胶电泳、NdeⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定。鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞诱导蛋白表达和纯化,15%SDS-PAGE和Western blotting鉴定。分别以乙酸苯酯、l-O-hexadecyl-2-deoxy-2-thioacetyl-sn-glycero-3-phosphocholine(2-Thio PAF)和1-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine为底物(后两者为血浆型PAF-AH的商业化底物),应用分光光度法检测纯化后重组蛋白的酶活性,以血浆型PAF-AH作为阳性对照。结果人细胞内PAF-AHⅠ型β亚基重组蛋白构建正确,纯化后在大肠杆菌感受态细胞中诱导表达。与阳性对照血浆型PAF-AH比较,纯化后的重组蛋白同样能够水解乙酸苯酯,具有芳香酯酶活性;能快速水解2-Thio PAF,但不能水解1-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidyl-choline。结论成功构建人细胞内Ⅰ型PAF-AH重组蛋白,其对血浆型PAF-AH的两个商业化底物具有完全不同的水解能力,以此可快速区分细胞内和血浆型PAF-AH。

钩端螺旋体血小板激活因子乙酰水解酶基因特征分析

目的 由于钩端螺旋体病的主要特征之一是组织器官广泛性出血 ,出血部位发生在黏膜、脏器、浆膜和皮肤等处 ,严重者出现大面积肺弥散性出血、咳血 ,是危重钩端螺旋体病早期最常见的死因 ,其致病机理仍不清楚。本文使用生物信息学软件分析钩端螺旋体基因LA2 14 4 (血小板激活因子乙酰化酶 ,PafAH)所编码蛋白的结构和功能 ,并探讨其在致病过程中的作用。方法 使用NCBI ,Swissprot/TrEMBL ,ProDom ,Pfam ,Jpred2 ,SWISS -MODEL ,TMpred ,SignalP ,ClustW对问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株全基因组ORF基因诠释 ,编码蛋白进行在线分析 ,并使用Bioedit软件进行氨基酸同源性比较分析。结果 确定了问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株血小板激活因子乙酰化酶基因 ,该基因编码蛋白质与哺乳动物 pafAH在一级结构上相似性达 4 2 % ,以牛脑 pafAH(Ib)γ亚基 (1WAB/PDB)为模件模拟该蛋白三级结构 ,发现两者立体结构与非常相似 ,催化位点完全相同 ,均由Ser-His-Asp组成催化三合体。结论 该基因可能与钩体染色体所编码的胶原酶基因 ,溶菌酶基因 ,YopM基因 ,VwA基因协同在钩端螺旋体病出血过程中起作用 。

脑出血与血浆血小板激活因子乙酰水解酶基因G994T突变的相关研究

目的探讨血浆血小板激活因子乙酰水解酶pPAF-AH基因G994T突变与中国人群脑出血发病的相关关系。方法利用等位基因特异性聚合酶链反应技术分析了150例原发性脑出血病人和150例非脑血管病对照组pPAF-AH基因的基因型位点频率。结果T等位基因在脑出血组的频率是3%,在对照组是4%,GT杂合子在脑出血组和对照组频率分别为6.8%和8.5%,两组差异无显著意义。没有发现突变型的纯合子。结论pPAF-AH基因G994T突变与中国人群的脑出血没有明显的相关关系。

细胞型血小板活化因子乙酰水解酶Ⅱ活力与急性脑梗死的关系

目的研究细胞型血小板活化因子乙酰水解酶Ⅱ（PAF-AHⅡ）活力与急性脑梗死的关系。方法采用PAF-AHⅡ活力检测试剂盒检测120例不同病程、梗死面积及病情的急性脑梗死患者的PAF-AHⅡ活力,并与健康对照组比较。结果脑梗死组病程1d、2-3d、4-7dPAF-AHⅡ活力明显高于健康对照组（均P〈0.01）,病程8-14d与健康对照组差异无统计学意义（均P〉0.05）;病程1d、2-3d、4-7d大面积脑梗死组的PAF-AHⅡ活力比中、小面积脑梗死组明显增高（均P〈0.05）,病程8~14d两组间差异无统计学意义（均P〉0.05）;病程≤7d脑梗死患者的PAF-AHⅡ活力与病情严重程度呈正相关（r=0.31,P〈0.05）,病程8-14d脑梗死患者的PAF-AHⅡ活力与病情严重程度无相关性（P〉0.05）。结论PAF-AHⅡ活力与急性脑梗死的发生、发展有密切关系,并对判断脑梗死的严重程度有一定意义。

血小板活化因子乙酰水解酶基因型与变应性鼻支气管炎的相关性

目的探讨血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)基因型与变应性鼻支气管炎(ARB)的相关性。方法应用等位基因特异性PCR技术检测变应性鼻支气管炎患者(病例组)及健康对照者(对照组)血浆中PAF-AH基因第9外显子994位点基因型,并计算等位基因频率。结果病例组与对照组PAF-AH基因第9外显子994位点基因型和等位基因频率比较,P均>0.05。变应性鼻炎(AR)并支气管哮喘(BA)患者的PAF-AH基因型频率与对照组、单纯AR患者、AR并变应性鼻炎气道高反应性(AHR)患者相比,P均<0.05。AR并BA患者的PAF-AH等位基因频率与对照组、单纯AR患者、AR并AHR患者相比,P均<0.05。结论 PAF-AH基因的等位基因突变和ARB病情有关。

血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性与黎族支气管哮喘相关作用的研究

目的探讨血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)基因多态性与黎族支气管哮喘之间的关系。方法采用等位基因特异性聚合酶链式反应技术等方法,检测108例黎族支气管哮喘患者及115例健康黎族人PAF-AH基因第9外显子Val279Phe基因多态性和酶活性。结果(1)哮喘组与对照组研究对象血浆PAF-AH突变基因型频率、突变等位基因频率间差别均无显著性意义(P>0.05);(2)哮喘缓解组与对照组研究对象血浆PAF-AH活性间差别无显著性意义(P>0.05),二者均高于哮喘发作组(P<0.001);(3)不论是在对照组,还是在哮喘缓解组,Val/Val基因型和Val/Phe基因型血浆PAF-AH活性间差别均有显著性意义(P<0.01),而两组研究对象在同一基因型中血浆PAF-AH活性间差别均无显著性意义(P>0.05)。结论海南黎族哮喘与PAF-AH基因型无关,但其哮喘所处状态与PAF-AH活性有关。

血小板激活因子与精子获能

血小板激活因子与其受体结合后 ,能明显促进精子的获能过程 ,血小板激活因子乙酰水解酶降解血小板激活因子抑制精子的获能。

妇女分娩前后血浆血小板激活因子水平的变化

采用生物分析法检测妇女孕３８周和分娩后１ｈ血浆血小板激活因子（ＰＡＦ）的水平，以了解分娩前后母体ＰＡＦ水平的变化及其与妊娠高血压综合征（妊高征）的潜在关系。结果：正常妊娠组孕３８周的ＰＡＦ活性为（２５．００±５．６５）μｇ／Ｌ，显著高于轻中度妊高征组［（１４．７４±４．５６）μｇ／Ｌ］和重度好高征组［（１１．４５±６．０８）μｇ／Ｌ］（均为Ｐ＜０．０５）。三组孕妇分娩后１ｈ的ＰＡＦ活性分别为（３３．９０±４．１２）、（３２．２８±５．９３）和（３５．９３±１０．８３）μｇ／Ｌ，均显著高于同组孕３８周的水平（均为Ｐ＜０．０５）。结果提示，血小板激活因子可能参与好高征的发病机制，而胎盘在血小板激活因子的代谢调节中具有重要的地位。

上海地区汉族健康人群PAF乙酰水解酶基因4号外显子275位点G/A单核苷酸多态性

目的了解血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)基因4号外显子275位点G/A位点单核苷酸多态性(SNP)在中国上海地区汉族健康人群中的分布及与其他种族比较的特点。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,对100名上海地区汉族健康者PAF-AH4号外显子275位点G/A位点的SNP进行了检测,计算其基因型和等位基因频率,并结合文献进行了不同种族间的分析比较。结果上海地区汉族健康人群GG基因型频率最高(88%),GA基因型次之(12%),未发现AA基因型。与英国人相比,上海地区汉族人群G等位基因频率较高。结论上海地区汉族健康人群G→A位点碱基突变率较低,其SNP与英国人相比分布存在明显差异。

变应性鼻支气管炎患者PAF-AH基因型与血浆PAF-AH活性的关系

目的探讨血小板活化因子—乙酰水解酶(PAF-AH)基因型与变应性鼻支气管炎(ARB)患者血浆PAF-AH活性的相关性。方法根据PAF-AH基因型的不同,将ARB患者及健康对照者分别分为GG型、GT型和TT型,对其3种基因型的血浆PAF-AH活性进行统计分析。结果在ARB患者及健康对照组中,不同基因型血浆PAF-AH活性差异有统计学意义(P均<0.05)。GG型血浆PAF-AH活性显著高于GT型及TT型,GT型血浆PAF-AH活性显著高于TT型,两两之间差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论 ARB患者PAF-AH不同基因型对血浆PAF-AH活性可能有明显影响。

类风湿性关节炎患者高凝血状态与核因子κB活化及致炎因子增加有关

目的基于核因子κB(NF-κB)信号转导通路探讨类风湿性关节炎(RA)患者高凝血状态的机制。方法选取RA患者35例,健康志愿者20例。ELISA检测两组血清中白细胞介素10(IL-10)、IL-6、IL-4、IL-17、NF-κB激活子1(Act1)、p50、p65、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、血小板激活因子(PAF)、PAF-乙酰水解酶(PAF-AH)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体水平,全自动血细胞分析仪检测血小板(PLT)数量,魏氏法检测血沉(ESR),全自动生化仪检测C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF),全自动凝血仪检测D-二聚体(D-D)、纤维蛋白原(FBG)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶原时间(APTT)水平;同时半定量反转录PCR检测Act1、p65、p50、IκBα、IκB激酶α(IKKα)mRNA水平,Western blot法检测p65、p50、IκBα蛋白水平。采用Spearman分析RA患者外周血中凝血纤溶指标与细胞因子、NF-κB、活动性指标以及临床症状体征之间的相关性。结果与正常组相比,RA患者外周血中D-D、FBG、PLT明显升高,TT缩短,APTT和PT无明显改变;RA患者血清IL-4、IL-10、PAF-AH的水平明显降低,IL-6、IL-17、Act1、p50、p65、IκBα、IKKα,PAF明显升高;相关性分析显示,RA患者外周血中凝血纤溶指标与细胞因子、NF-κB、活动性指标以及临床症状体征均明显相关。结论 RA患者体内普遍存在高凝状态,并与炎性因子、活动性指标及NF-κB异常活化密切相关。

初发2型糖尿病患者血清LTB_4与PAF-AH改变的意义研究

目的探讨初发2型糖尿病患者外周血中白三烯B4(LTB4)与血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)活性变化的临床意义。方法用ELISA法检测55例初发的2型糖尿病患者血清中LTB4含量与PAF-AH活性,与25例健康体检者对照,并比较它们与患者空腹血糖、HbAlc和空腹胰岛素之间的关系。结果2型糖尿病患者血清中LTB4含量(864.69±202.67)ng/L与健康对照组(353.31±120.93)ng/L比较,差异有显著性(P<0.01);而2型糖尿病患者血清PAF-AH活性(9.36±3.14)!mol/min·L与健康对照组(6.11±1.23)!mol/min·L比较有显著性差异(P<0.01)。2型糖尿病空腹血糖FBG(12.54±4.94)mmol/L、HbAlc(10.23±3.13)%和空腹胰岛素FINS(10.9±11.1)mU/L与外周血LTB4含量和PAF-AH活性之间均呈明显的正相关性(P均<0.01),患者外周血LTB4含量与PAF-AH活性之间也呈明显的正相关性(P<0.01)。结论2型糖尿病患者存在炎症反应,血清LTB4与PAF-AH活性明显升高,提示它们可能共同参与了初发2型糖尿病的病理生理过程,可作为初发2型糖尿病患者病情变化的监测指标之一。

苯巴比妥对癫患者血浆型PAF-AH酶活力的影响

目的检测苯巴比妥癫癎患者血浆型血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)活性,了解苯巴比妥抗癫癎治疗对免疫功能的影响。方法采用ELISA法测定16例单药PB抗癫癎治疗未发作EP患者,14例单药PB抗癫癎治疗发作患者及16例健康对照组的血浆型PAF-AH活性。结果癫癎未发作组、癫癎发作组和健康对照组血浆型PAF-AH活性分别为(15.91±1.59)、(17.66±1.46)(、15.52±1.18)nmol/(min.μl),发作组血浆型PAF-AH活性高于健康对照组(P<0.01),未发作组与对照组无显著差异(P>0.05)。结论单药苯巴比妥抗癫癎治疗EP患者发作后血浆型PAF-AH活性升高,可能是机体的一种自我保护措施。

血小板激活因子与α-肿瘤坏死因子在新生儿NEC中的作用

为探讨血小板活因子(PAF)及α-肿瘤坏死因子(TNF-α)在新生儿坏死性小肠结炎(NEC)中的作用,作者测定了12例新生儿NEC血浆PAF、乙酰水解酶(PAF裂解酶)和TNF-α,并选择8例无胃肠道症状和体征的患儿为对照组。结果NEC组2例PNF含量轻度升高(】5ng/ml),10例显著升高(10ng/ml),对照组仅2例】3ng/ml(未超过10ng/ml)。两组比较有极显著差异,提示在感染性或炎症性疾病时PNF含量均可升高,但在NEC时显著性升高。乙酰水解酶使PNF降解为一种生物惰性化合物一可溶性PAF,

心力衰竭患者血小板活化因子及其受体表达的变化

目的 :探讨心力衰竭患者血浆血小板活化因子 (PAF)、血小板活化因子乙酰水解酶 (PAF AH)活性的变化 ,以及外周血中单个核细胞 (PBMC)PAF受体 (PAF R)的表达。方法 :对 30例心力衰竭患者采用生物法检测血浆中PAF含量 ,酶水解底物显色法测定PAF AH活性 ,流式细胞仪检测PBMC上PAF R的表达。并与 30例健康体检者对照。结果 :心力衰竭患者血浆中PAF含量 (11.12± 1.80 ) μg L ,PAF AH活性 (2 4 .5 0± 7.86 ) μmol (min·L)、PBMC上PAF R的表达与健康体检者比较差异有非常显著性意义 (P <0 .0 1)。结论 :PAF、PAF AH、PAF

PAFAH1B3表达水平与多发性骨髓瘤患者自体造血干细胞移植后疾病进展风险的相关性

目的:探讨接受自体造血干细胞移植(AHSCT)治疗的多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓CD138^(+)细胞中血小板激活因子乙酰水解酶1B3(platelet-activating factor acetylhydrolase 1B3,PAFAH1B3)基因表达水平与2年内预后之间的相关性。方法:选取2014年5月至2019年5月间于南通大学第一、第二附属医院就诊的147例行AHSCT治疗的MM患者作为研究对象,检测患者骨髓CD138^(+)细胞中PAFAH1B3 mRNA的表达水平,并将随访2年间疾病进展或死亡者纳入进展组,其余纳入预后良好组。比较两组患者的临床资料和PAFAH1B3 mRNA表达水平,以入组患者PAFAH1B3 mRNA表达水平中位数为界将患者分为PAFAH1B3高表达组和低表达组,采用Kaplan-Meier法比较两组患者的无进展生存率(PFSR)。应用单因素分析和多因素COX回归分析法分析患者2年内预后的相关因素。结果:随访结束时共有13/147例患者失访,最终进展组纳入44例,预后良好组纳入90例。进展组年龄高于预后良好组,移植后达CR^(+)VGPR患者比例低于预后良好组,两组ISS分期例数分布差异有统计学意义(均P<0.05);进展组PAFAH1B3 mRNA表达水平和LDH>250 U/L患者比例均高于预后良好组,PLT值低于预后良好组(均P<0.05);PAFAH1B3高表达组2年PFSR显著低于低表达组(log rankχ^(2)=8.167,P=0.004);LDH>250 U/L(HR=3.389,P=0.010)、PAFAH1B3 mRNA表达水平(HR=50.561,P=0.001)和ISSⅢ期(HR=1.000,P=0.003)为患者预后的独立危险因素,ISSⅠ期(HR=0.133,P=0.001)为患者预后的独立保护因素。结论:接受AHSCT治疗的MM患者骨髓CD138^(+)细胞中PAFAH1B3 mRNA表达水平与预后相关,检测PAFAH1B3 mRNA表达水平对预测患者的PFSR和预后分层具有一定意义。

大熊猫精浆中PAF-AH和GOT水平与精液质量的关系

本研究检测了大熊猫精浆血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)和谷草转氨酶(GOT)活性,初步探讨了这些物质与大熊猫精液质量的关系。结果显示,大熊猫精浆存在PAF-AH和GOT,其平均水平分别为(56.76±60.86)mmol.min-1.mL-1和(1 948.9±774.0)IU/L,PAF-AH含量高低与精子活力呈高度负相关(R=-0.73,P<0.001),与精子运动状态呈负相关(R=-0.58,P<0.05);GOT含量高低与精子活力显著负相关(R=-0.66,P<0.01)。这些结果表明,大熊猫精浆PAF-AH和GOT活性之高低可作为评价大熊猫精液质量的参照指标。