中药复方M3对雏鸭体内感染Ⅰ型鸭肝炎病毒的防治效果研究

本试验旨在研究中药复方M3对感染Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHAV-1)雏鸭的体内治疗效果。选取60只雏鸭,随机分为6组,每组10只。试验组分别为空白组(Blank)、病毒组(Virus)、清瘟解毒口服液组(QW)、中药复方高剂量组(M3_(H))、中剂量组(M3_(M))和低剂量组(M3_(L))。给药组在2日龄开始饮水给药,连续给药至实验结束,共11 d。除空白组外,在给药第4 d时进行攻毒,0.5 mL/只。比较各试验组雏鸭的病死率;对病死鸭和各组存活鸭进行解剖,观察肝脏和小肠的病理剖检及HE染色切片;分析雏鸭血液中DHAV-1 VP1基因拷贝数;检测分析血清过氧化指标(GSH-Px、MDA、SOD、CAT、iNOS)及生化指标(ALT、AST、TP、ALB、TBIL、DBIL、CHE、LDH、GGT),评价中药复方对感染鸭肝炎雏鸭的治疗效果。结果显示,中药复方M3中、高剂量组能够有效降低雏鸭死亡率;与病毒组相比,经过中药复方M3治疗后,能够显著降低雏鸭血液中DHAV-1 VP1基因拷贝数(P<0.05),感染雏鸭的肝损伤和氧化应激反应均减轻,且显著降低了感染雏鸭的ALT、LDH的含量(P<0.05)。以上结果表明,中药复方M3中、高剂量对鸭肝炎具有一定的防治效果,且中药复方M3中剂量更具有继续开发研究的可能。

HBx蛋白抑制乙型肝炎病毒诱导肝细胞表达Ⅰ型干扰素的研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)对Ⅰ型干扰素表达的影响,并进一步探讨相关机制。方法:以HepG2细胞和稳转HBV基因组的HepG2.2.15细胞为模型,转染针对乙型肝炎病毒X(HBx)基因的小干扰RNA(siRNA)[HBx-siRNA]至HepG2.2.15细胞,转染HBx蛋白表达质粒pEGFP-HBx至HepG2细胞,荧光定量PCR技术分析各细胞中的IFN-α、IFN-β mRNA含量,荧光显微镜观察HepG2细胞内质粒pEGFP-HBx的表达,Western blot技术分析各细胞中HBx和p-IRF3蛋白含量变化,以探讨HBV通过HBx蛋白对Ⅰ型干扰素表达的影响。结果:IFN-α和IFN-β mRNA在HepG2.2.15细胞中的含量略高于HepG2细胞,差异无统计学意义(P>0.05);RNA干扰抑制HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达后,细胞中IFN-α、IFN-β mRNA含量显著升高,转染pEGFP-HBx的HepG2细胞中Ⅰ型干扰素的基因表达量和p-IRF3的蛋白表达量均降低。结论:HBV通过HBx蛋白抑制IRF3蛋白的活化,从而抑制Ⅰ型干扰素的表达。

Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)在鸡胚中的增殖及感染力的测定

为确定所分离Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)毒力,为DHV单克隆抗体研究做好前期准备。将Ⅰ型鸭肝炎病毒接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔(0.2 mL/胚)进行增殖,制备鸡胚成纤维细胞(CEF),并分别运用鸡胚半数致死量(CELD50)法和组织培养半数感染量(TCID50)法测定DHV的感染力。结果显示,DHV-Ⅰ在SPF鸡胚内成功增殖,致死鸡胚具有典型临床症状和体表特征,所增殖病毒的CELD50和TCID50分别为10-5.6/0.2 mL和10-5.12/0.1 mL。结果表明,该分离毒株毒力较强,是进行DHV单克隆抗体研究的理想抗原。

Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离鉴定及其高免卵黄抗体的制备

为了确定山东某养殖场疑似患有鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)病死鸭的病原,并针对该病原制备高效且安全的卵黄抗体(antibody of yolk,IgY),试验无菌采集病死鸭肝脏组织样品,通过细菌检测、病毒的分离与增殖、特异性基因的RT-PCR鉴定与序列分析及动物回归试验确定病原,采用Reed-Muench法计算半数致死量(LD_(50)),并针对病原制备油乳剂灭活苗,按照免疫程序将其免疫产蛋鸡,收集免疫鸡的鸡蛋,采用生理盐水法提取IgY,测定IgY的中和效价,最后进行动物被动免疫试验,探究IgY对攻毒雏鸭的免疫保护作用。结果表明:将病死鸭肝脏组织划线接种于营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基,培养后均无细菌生长,病死鸭肝脏组织和增殖尿囊液均扩增出Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)特异性基因片段,目的基因与GenBank中的9株DHV-Ⅰ参考株的相应基因序列的相似性为99.1%~99.2%,确定分离出1株DHV-Ⅰ,命名为SD,分离株SD对9日龄鸭胚的LD_(50)为1×10^(-8.25)/0.2 mL。将分离株重新接种健康雏鸭,出现DVH典型的症状,死亡率为100%,提取死亡雏鸭肝脏组织中的病毒RNA,经RT-PCR后能扩增出目的条带,测序结果与分离株SD一致。制备的油乳剂灭活苗稳定性良好,30 min内不分层,雏鸭注射后14 d内生长无异常。制备的IgY抗体中和效价为1∶256,注射IgY后第1~5天攻毒,10 d后的保护率为87.5%~100%,注射IgY后第7天攻毒,10 d后的保护率为75%。说明从发病鸭群肝脏组织中分离出1株高致病性的DHV-Ⅰ,制备的油乳剂灭活苗免疫蛋鸡后获得高效价IgY,对攻毒雏鸭具有很好的免疫保护作用。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据获得的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒（DHVⅠ）RNA聚合酶基因序列，应用Primer Premier5．0软件设计了1对引物，建立了检测DHVⅠ的RT-PCR方法。该法能从DHVⅠ中扩增到440bp的条带，而对正常鸭胚尿囊液、健康鸭肝、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒、禽流感病毒（H5N2亚型）、鸭病毒性肿头出血症病毒、鸭源多杀性巴氏杆菌（5：A）的扩增结果均为阴性。该法最低可以检测到30pg的DHV工核酸模板。RT-PCR对DHVⅠ强毒CHv-1株人工感染发病死亡鸭肝的检测结果与病毒分离和Dot—ELISA检测结果的阳性检出率均为100％，对脾、肺、脑病料的检出率显著（P≤0．01）高于病毒分离和Dot-ELISA。RT-PCR、病毒分离和Dot—ELSA对1987～2005年采集且保存于-20℃的经病毒分离已确诊为鸭肝炎的临床送检肝病料的检出率分别为100％（19／19）、36．84％（7／19）和57．98％（11／19），对2000-2005年采集且于-20℃保存的来源于中国18个省份发病鸭群的48份肝病料的检出率分别为100％（48／48）、56．25％（27／48）和75．00％（36／48）。结果表明，建立的RT—PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于DHVⅠ的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。

Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的逆转录套式PCR方法(RT-nested-PCR),采用该方法对DHV-ⅠA66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎(DVH)的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了一对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的RT-PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到了预期大小为699 bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的DHV-Ⅰ的相应基因序列比对分析,同源性均达90%以上,表明为DHV-Ⅰ的基因序列,对NDV,IBDV,DPV和GPV等常见病毒扩增结果为阴性。该方法敏感性检测结果表明,最低RNA模板检出量为24 pg。表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于I型鸭病毒性肝炎病毒的快速诊断。

Ⅰ型鸭肝炎病毒概述

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种高度致死性、高度传播性的传染病。DHV分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,3个型之间无交叉保护作用。Ⅰ型DHV呈世界性分布,并常和其他病毒、细菌混合感染,对养鸭业危害严重,造成了巨大的经济损失。论文从Ⅰ型鸭肝炎病毒的病原特点、分类地位、分离培养、基因组结构和功能以及病毒的诊断与防控等方面,介绍了DHV-Ⅰ的研究概况。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中公布的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和实验室分离到的Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ株、Ⅰ型鸭病毒性肝炎R株所测序列（GenBank登录号分别为EU841005和EF585200）以及新型鸭肝炎病毒全基因组序列，应用PrimerPrimier5．0软件，在序列保守区域分别设计了2对鉴别引物，成功建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的鉴别RT—PCR检测方法。结果表明：该方法能从Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒中扩增到与预期相符的471bp条带，从广东佛山分离到的新型鸭肝炎病毒FS株中扩增到705bp的条带，设计的2对引物能够特异性地检测出Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒，特异性好；分别能够检测出模板含量为0．8ng／μL和1．0ng／μL的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒。因此，该方法可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭病毒性肝炎临床样品的鉴别诊断和分子流行病学调查。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列,设计一对特异性引物。通过RT-PCR的方法扩增DHV-Ⅰ(A66株)VP3基因并将其5′端起始处稀有密码子同义突变。用限制性内切酶BamHⅠ/SalⅠ消化VP3基因片段和表达载体pGEX-6p-1后构建重组表达质粒pGEX-VP3,转化E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析表明,VP3基因在大肠埃希菌中大量表达,表达产物的分子质量约为52 ku。Western blot检测表明,表达产物能与DHV-Ⅰ阳性血清发生反应,具有反应原性。

抗Ⅰ型鸭肝炎病毒RdRp蛋白噬菌体单链抗体库构建及单链抗体的淘选

为构建抗1型鸭肝炎病毒(DHV-1)RdRp蛋白的单链抗体(scFv)库,并淘选特异性scFv,本研究采用RT-PCR方法从DHV-1基因组中扩增Rd Rp基因,将其克隆于pET-32a载体中进行重组RdRp蛋白原核表达。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,以提取的免疫鼠脾脏总RNA为模板,利用抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)简并引物,经RT-PCR扩增抗体的VL和VH编码序列,由Linker序列连接,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)扩增完整的sc Fv基因(VL-Linker-VH)。将扩增的scFv基因克隆于pCANTAB5E载体中构建噬菌体scFv文库,利用纯化的重组RdRp蛋白开展4轮吸附-洗脱-富集以淘选抗RdRp的ScFv;最后对淘选到的阳性ScFv进行可溶性表达,以ELISA方法检测其免疫结合活性。结果显示,获得了7株具有良好抗原结合活性的ScFv。淘选到的DHV-1 RdRp特异的基因工程ScFv,为鸭病毒性肝炎防制新策略研究奠定了基础。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎研究进展

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭一种高度致死、高度传播性的病毒性传染病。该病以肝炎为主要特征,具有高发病率和高病死率。DHV分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,3个型之间无交叉保护作用。Ⅰ型DHV呈世界性分布,并常和其他病毒、细菌混合感染,严重影响了养鸭业,造成了巨大的经济损失。文章对Ⅰ型DVH病原学、致病机理、分子生物学诊断技术和防控等方面进行了综述。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因重组鸭瘟病毒载体的构建

为了构建含有Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒,将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,在其绿色荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因,将重组后的转移载体(pBlueSK-TK-EGFP-VP1)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞.原始病毒液在鸭胚成纤维细胞上盲传3代后仍能观察到绿色荧光;以Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清对pBlueSK-TK-EGFP-VP1转染的细胞样品作Westen-blot检测,出现特异条带,且相对分子质量约为54 000.结果表明该研究已成功构建携带Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体,其能够在真核细胞中正确表达.

Ⅰ型鸭肝炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

用RT-PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),建立Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速检测方法。根据获得的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV I)RNA聚合酶基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了1对引物,RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。以正常鸭胚尿囊液、正常鸭肝组织、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、H5N1亚型禽流感病毒、鸭源新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒作对照进行特异性检测;将强毒株核酸稀释成不同梯度,做灵敏度检测;同时将该方法与病毒分离和荧光定量RT-PCR方法做人工感染样品的平行检测。结果表明,该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到4 pg的DHV I核酸模板,与荧光定量PCR检测结果一致。PCR-DHPLC对DHVⅠ强毒株人工感染鸭组织脏器的检测结果与荧光定量PCR检测结果的阳性检出率均为100%,对脑、脾、肺病料的检出率显著(P≤0.01)高于病毒分离,PCR-DHPLC与荧光RT-PCR检测方法相比较,两种方法检测DHVⅠ的符合率为100%。研究表明该方法可用于诊断Ⅰ型鸭肝炎病毒,是一种有效的新方法。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆及原核表达

采用RT-PCR方法从Ⅰ型鸭肝炎病毒ZJ-Ⅴ株中扩增VP3基因,运用DNAStar软件对VP3序列与参考序列的同源性进行比对,并进行了遗传进化分析,然后将VP3基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),获得重组表达质粒pET-VP3,转化宿主菌E.coli Rosetta(DE3),经1mmol/L IPTG诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达产物进行检测。结果显示,成功克隆了DHV-ⅠVP3基因,片段大小为711bp。序列分析结果表明,ZJ-Ⅴ株VP3与其他A型DHV分离株的同源性较高,为95.1%～97.7%;而与C型DHV分离株的同源性较低,为71.3%～72.6%;与B型DHV分离株的VP3基因同源性最差,为70.3%～70.5%。SDS-PAGE和Western blotting检测结果显示,重组VP3基因在大肠杆菌细胞(DE3)中获得了良好表达,其分子质量约为47ku;与抗Ⅰ型鸭肝炎病毒ZJ-Ⅴ株阳性血清发生特异性免疫反应,表明重组VP3蛋白具有良好免疫原性。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP3基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白VP3,首先根据DHAV-I SH株VP3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出VP3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP3,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-VP3,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒r Bac-VP3。间接免疫荧光结果显示重组蛋白获得了正确表达,能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。Western blot结果显示表达的重组蛋白分子量约为27 000。表明,DHAV-I SH株的主要结构蛋白VP3在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP3结构蛋白的功能研究及相关亚单位疫苗的研制奠定了基础。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据已经发表的Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因序列,设计1对特异性引物(上下游分别插入Bam H I和Sac I酶切位点),利用PCR技术扩增出VP1基因,经Bam H I和Sac I双酶切后,将其克隆至原核表达载体p ET-32a上,获得重组表达质粒p ET-VP1。重组质粒转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),重组蛋白经IPTG诱导成功表达。将重组蛋白切胶免疫6周龄的BALB/c小鼠,3次免疫后采血,制备DHV-Ⅰ的多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,成功表达出的重组蛋白分子量约为46 000。Western-blotting分析结果表明,该重组蛋白可与His组氨酸鼠单克隆抗体发生特异性反应,Western-blotting检测抗鼠DHV多抗的结果显示,DHV多抗能与目的蛋白发生特异性反应。以上结果表明,DHV的VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的DHV多抗能用于VP1蛋白表达的检测。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的原核表达及其抗原性

参考GenBank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)全基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增了DHV-ⅠVP3基因,将VP3基因与pET-28a(+)表达载体连接后,转化宿主BL21(DE3),用0.1 mmol·L-1的IPTG诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。电泳结果表明,VP3在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为27 kD。免疫印迹试验表明Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-Ⅰ)的主要结构蛋白VP1,根据GenBank已发表的DHAV-ⅠSH株VP1基因序列,设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP1,将其转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定后,构建重组穿梭质粒rBacmid-VP1。在脂质体介导下将重组质粒rBacmid-VP1转染昆虫细胞Sf 9,制备含有DHAV-ⅠVP1基因的重组杆状病毒rBac-VP1。Western blot结果显示,表达的重组蛋白VP1大小约27 ku,能与DHAV-ⅠVP1多克隆抗体发生特异性反应;间接免疫荧光检测结果显示,重组蛋白VP1能与DHAV-Ⅰ全病毒阳性血清发生特异性反应,细胞内出现较强的荧光。以上结果表明,在昆虫细胞中成功表达了具有免疫原性的DHAV-Ⅰ主要结构蛋白VP1。

Ⅰ型鸭肝炎病毒鸡胚致弱毒MY株的培育及实验研究

将Ⅰ型鸭肝炎分离株XC-1适应鸡胚,培育成1株毒力弱而稳定、免疫原性良好的鸭肝炎鸡胚化MY弱毒株。该毒株毒力为1011.40ELD50/0.1mL,1013.62TCID50/0.1mL;对雏鸭无致病性;在雏鸭体内连续盲传5代未见毒力返强;1日龄雏鸭用8,000 ELD50/0.1mL的MY株致弱毒腿部肌注0.2ml免疫后3d强毒原液0.5mL/只攻击,可产生2/5的保护,第6d-21d产生完全保护,免疫后第3d、5d、6d、7d、9d、14d、21d抗DHVⅠ的中和抗体滴度分别为10-1.38、10-1.55、10-1.64、10-1.65、10-1.68、10-1.8、10-1.89,表明MY是1株理想的鸡胚弱毒疫苗后备株;通过MY株的鸡胚的繁殖规律观察,确定该病毒的最佳收毒时间为接胚后的72h^84h,为疫苗生产条件的建立提供了依据。