几种因素对芹菜CEL Ⅰ核酸酶提取的影响

为有效提取芹菜CEL Ⅰ核酸酶和进一步利用它建立点突变检测技术,分析了品种、器官、发育时期和提取液pH值对其提取量的影响,并以含有单个错配的DNA异质双链为底物鉴定其对错配切割的酶学活性.结果表明:不同芹菜品种和器官间CEL Ⅰ提取量的差异分别达到显著和极显著水平,在比较的3个不同品种(雪白、文图拉和泰国黄心芹)中,以品种泰国黄心芹的CEL Ⅰ提取量最高;而在测定的3种不同器官中,叶片的CEL Ⅰ提取量远远高于茎秆和根;以上海黄心芹为材料比较发育时期对提取量的影响表明,生殖生长期的CEL Ⅰ提取量明显高于营养生长期;缓冲液pH值对CEL Ⅰ提取量也有重要影响,pH 7.5缓冲液的CEL Ⅰ核酸酶提取量高于pH 5.5和pH 9.5;酶学活性鉴定显示,CEL Ⅰ核酸酶粗提物能有效地识别和切割DNA异质双链中的碱基错配.

芹菜不同器官、品种CELⅠ核酸酶提取的比较

随着TILLING技术的发展,发挥关键作用的芹菜CELⅠ核酸酶也得到了越来越广泛的应用。鉴于其活性直接影响突变体检测的效果,而芹菜粗提物中CELⅠ核酸酶的含量和活性因提取组织及提取程序不同而有较大变化,所以本研究分析了芹菜不同器官、品种等因素对CELⅠ核酸酶粗提物提取量的影响,并用只含有1个碱基差异的2个目的DNA片段形成的杂交链为底物对其活性进行了鉴定。结果表明:芹菜不同器官和品种间的CELⅠ核酸酶提取量存在较大差异。不同器官的榨汁率和提取量,以茎的出汁率最高,而叶片中的提取量显著高于根和茎中的提取量;在本研究所用的3个品种中,以山东地方品种马家沟芹的提取量最高,山芹次之,西芹的提取量最低;CELⅠ核酸酶的活性鉴定表明,CELⅠ核酸酶粗提物能有效切割DNA双链中的错配碱基。

单活性结构域T7核酸酶Ⅰ的制备及性质研究

T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和His-tag融合的两种T7EⅠ突变体,MBP-T7EⅠ(E20K)和His6-T7EⅠ(E65K).每一种融合蛋白形成的同源二聚体不具有核酸酶活性,通过共表达或两种蛋白质共变性复性、双标签亲和纯化,最终获得具有单个活性结构域的T7EⅠ异源二聚体(T7EⅠ-SAD).以pUC(AT)和pUC19为底物测试T7EⅠ-SAD的HJ拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切割活性,结果显示,T7EⅠ-SAD可特异识别并切刻HJ结构,但丧失了同时引入两个切刻位点的能力,其对pUC(AT)的特异切刻活力和对pUC19的随机切刻活力与野生酶相当.逐级变性梯度洗脱实验显示,T7EⅠ-SAD的稳定性与野生型酶接近,二聚体解离需要5.0～6.0mol/L尿素或1.75～2.0mol/L盐酸胍;凝胶阻滞实验表明T7EⅠ-SAD具备与HJ结构特异结合的能力.为具有细胞毒性蛋白的表达提供了一种新策略,同时提供了一种简便直观的蛋白质二聚体稳定性测试方法.

酶联适配体传感器比色检测牛奶中恩诺沙星残留

通过裁剪分析和共聚焦成像鉴定了适配体的结合域,根据结合域位于3′端茎-环的特点,建立了外切核酸酶Ⅰ依赖的酶联核酸适配体比色分析法检测恩诺沙星残留。波长450 nm吸光度与恩诺沙星浓度呈线性关系,方法的线性范围为36~254μg/L,检测限为15μg/L。实际试样检测显示:15个牛奶样本里有6个检出恩诺沙星残留,残留量在43~152μg/L之间。标准加入回收实验的平均回收率在93.5%~99.6%之间,批内变异系数为6.03%~8.12%,批间变异系数为7.31%~13.42%。该方法操作简便、快速,灵敏度高、特异性强,适合批量样品快速分析和现场快速检测。