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SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法快速鉴定新城疫病毒毒力
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作者 伍祥龙 殷俊磊 +3 位作者 伍明山 文明 周碧君 李永明 《畜牧与兽医》 北大核心 2008年第11期80-83,共4页
为快速鉴定不同新城疫病毒株(NDV)毒力,我们以NDVF蛋白裂解位点附近的基因序列自行设计1对引物,对不同毒力NDV毒株进行荧光RT—PCR扩增,根据其扩增效率及扩增产物熔解温度(Tm)值大小进行NDV毒株毒力的鉴定,建立了能区分NDV强弱... 为快速鉴定不同新城疫病毒株(NDV)毒力,我们以NDVF蛋白裂解位点附近的基因序列自行设计1对引物,对不同毒力NDV毒株进行荧光RT—PCR扩增,根据其扩增效率及扩增产物熔解温度(Tm)值大小进行NDV毒株毒力的鉴定,建立了能区分NDV强弱毒株的SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法;同时将其与鸡胚平均致死时间(MDT)测定和F蛋白裂解位点序列分析结果进行比较。结果发现:建立的SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法只需4h即呵判定结果,NDV强弱毒株扩增产物Tm值为(83±0.5)℃且有2个峰值,阴性对照Tm值为(81±0.5)℃且只有1个峰值;对NDV强毒株的扩增效率即Ct值在11-20之间,NDV弱毒株Ct值在25~30之间,阴性对照Ct值在30以上,Ct值在20~25之问为强弱毒株混合物。该方法检测结果与MDT测定和F蛋白裂解位点分析结果一致。应用SYBRGreenI模式荧光RT—PCR方法与普通RT—PCR方法和鸡胚接种鉴定方法分别对80份临床组织样品进行检测,强毒株的检出率均为53.75%(43/80),而弱毒株的检出率相应为31.25%(25/80)、27.50%(22/80)和35.00%(28/80),检出符合率达89.3%以上。这些结果表明建立的SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法具有特异、准确、快速等特点,可用于临床病料样本NDV毒株的毒力鉴定。 展开更多
关键词 新城疫病毒 SYBR Green Ⅰ模式荧光RT—PCR 毒力 鉴定
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SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立 被引量:12
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作者 熊文婕 谢芝勋 +5 位作者 唐熠 谢丽基 刘加波 庞耀姗 邓显文 谢志勤 《广西农业科学》 CAS CSCD 2010年第4期366-370,共5页
为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选... 为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 δC基因 δNS基因 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR 相对定量
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检测微囊藻毒素合成酶基因mcyH的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量:3
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作者 方志慧 许敏 +1 位作者 程凯 赵以军 《华中师范大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 2008年第3期452-455,共4页
利用RT-PCR方法从铜绿微囊藻PCC7806 mcy基因中扩增出目的基因片段,用TA克隆方法将基因片段插入pGEMT-T Easy中来制备质粒标准品.通过不同连续稀释倍数的质粒标准品成功构建了16srRNA和mcyH两基因的标准曲线,该法构建的两基因标准曲线r... 利用RT-PCR方法从铜绿微囊藻PCC7806 mcy基因中扩增出目的基因片段,用TA克隆方法将基因片段插入pGEMT-T Easy中来制备质粒标准品.通过不同连续稀释倍数的质粒标准品成功构建了16srRNA和mcyH两基因的标准曲线,该法构建的两基因标准曲线r2分别为0.9916和0.9938,且质粒标准品具有较好的重复性,满足实时荧光定量RT-PCR的要求. 展开更多
关键词 mcyH 实时荧光定量RT—PCR SYBR Green
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比格犬IFN-α和IFN-β mRNA SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 潘福星 王冬冬 +6 位作者 曹志伟 冯培祥 刘宏 齐娟 孙忠晟 王祖荣 尹燕博 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期297-300,共4页
为检测比格犬α和β-干扰素(CaIFN-α和CaIFN-β),本研究根据GenBank中登录的IFN-α和IFN-β基因序列,分别设计合成特异性引物,以犬3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增IFN... 为检测比格犬α和β-干扰素(CaIFN-α和CaIFN-β),本研究根据GenBank中登录的IFN-α和IFN-β基因序列,分别设计合成特异性引物,以犬3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增IFN-α、IFN-β和GAPDH的基因片段,并克隆于pMD19-T载体中制备标准品,建立荧光定量RT-PCR标准曲线。结果表明:IFN-α和IFN-β和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×102拷贝/μL^1×108拷贝/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.994。组内组间变异系数均小于3%,特异性和重复性较好。同时采用常规RT-PCR方法与本研究建立的方法对30份临床样品检测,结果显示IFN-α和IFN-β的阳性符合率分别为96.43%和96.55%。本研究建立的检测方法为比格犬IFN mRNA的定量分析提供了有效手段。 展开更多
关键词 SYBR Green 实时荧光定量RT—PCR 比格犬 α-干扰素 Β-干扰素
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荧光定量RT-PCR检测神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA的表达 被引量:3
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作者 冯晨 唐锁勤 +3 位作者 王建文 刘立真 高晓宁 龙卉 《中国当代儿科杂志》 CAS CSCD 2007年第1期47-50,共4页
目的MYCN基因表达对神经母细胞瘤的治疗及预后评估有指导意义,目前国内对于MYCN基因mRNA的定量检测未见报道,该研究拟采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ(SYBRGREENⅠ)实时检测的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测神经母细胞瘤细胞系LA-N-5细胞... 目的MYCN基因表达对神经母细胞瘤的治疗及预后评估有指导意义,目前国内对于MYCN基因mRNA的定量检测未见报道,该研究拟采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ(SYBRGREENⅠ)实时检测的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测神经母细胞瘤细胞系LA-N-5细胞MYCN基因mRNA的表达,并对其可行性及实用性进行研究,力争探索出微量瘤标本的MYCN基因mRNA定量检测的可行方法。方法提取神经母细胞瘤细胞系LA-N-5细胞总RNA,采用SYBRGREENI实时检测的RT-PCR检测其MYCN基因mRNA的表达,并用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照,将MYCN基因的mRNA拷贝数与GAPDH的拷贝数相除,结果为单细胞MYCN基因mRNA的表达水平。结果反应标准曲线有良好的相关性(R2>0.99),PCR产物特异,神经母细胞瘤细胞系LA-N-5MYCN基因mRNA的表达水平为17.4±1.2。结论只要严格控制PCR反应条件,SYBRGREENⅠ定量RT-PCR法可以作为一种良好的定量PCR方法对神经母细胞瘤细胞系LA-N-5MYCN基因mRNA的表达进行检测,此方法为临床微量神经母细胞瘤瘤组织的MYCN基因mRNA的定量检测提供了可能。 展开更多
关键词 神经母细胞瘤 MYCN 荧光定量RT—PCR 绿色荧光染料Ⅰ
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鸭IFN-γ mRNA实时荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量:7
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作者 谢秀兰 汤承 +1 位作者 杨发龙 岳华 《动物医学进展》 CSCD 2008年第5期17-20,共4页
为建立检测鸭IFN-γ mRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法,根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ染料,建立检测鸭IFN-γ mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法(real-time RT-PCR)。试验以PCR产... 为建立检测鸭IFN-γ mRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法,根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ染料,建立检测鸭IFN-γ mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法(real-time RT-PCR)。试验以PCR产物为标准品,建立标准曲线,随后进行熔解曲线分析和稳定性研究。结果Ct值线性范围为12.0~33.0,相关系数为0.997;熔解曲线显示产物为单特异峰,Tm为82.5±0℃;组内变异系数(CV%)为4.26%;纽间试验无显著差异(P〉0.05)。建立的检测鸭IFN-γ mRNA的Real—time RT—PCR方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。 展开更多
关键词 Γ干扰素 实时荧光定量RT—PCR SYBR Green
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鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量:6
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作者 谢丽基 谢芝勋 +4 位作者 邓显文 谢志勤 庞耀珊 范晴 刘加波 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1184-1189,共6页
根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性... 根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,对鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检测敏感性均达到200个模板拷贝数;该方法特异性强,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。本研究建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测。 展开更多
关键词 鸭Ⅰ型肝炎病毒 番鸭细小病毒 二重荧光定量RT—PCR
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拓扑替康对鼻咽癌体外放射后拓扑异构酶Ⅰ基因mRNA表达水平的变化 被引量:1
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作者 何芬 范海虹 +2 位作者 邹俊涛 文庆莲 吴敬波 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第B03期51-53,共3页
【目的】观察拓扑替康对鼻咽癌体外放射后拓扑异构酶Ⅰ基因mRNA表达水平的变化,初步探讨拓扑替康对鼻咽癌体外放射增敏作用的分子水平机制。【方法】应用实时荧光定量RT-PCR技术检测人鼻咽癌高分化细胞系(CNE-I)经照射及照射加拓扑替康(... 【目的】观察拓扑替康对鼻咽癌体外放射后拓扑异构酶Ⅰ基因mRNA表达水平的变化,初步探讨拓扑替康对鼻咽癌体外放射增敏作用的分子水平机制。【方法】应用实时荧光定量RT-PCR技术检测人鼻咽癌高分化细胞系(CNE-I)经照射及照射加拓扑替康(topotecan)后其中拓扑异构酶I(topoisomerase I,TOPO-I)基因mRNA表达水平。【结果】单纯照射组在1、2、3、4、6、8、10Gy剂量下TOPO-I基因mRNA水平(copies/μl)分别为152566±1.3、16694±1.1、11770±1.1、2112±1.2、1699±1.3、2.98±1.0、1.69+1.1,较对照组差异具有统计学意义(P<0.01);照射加药组在相同剂量下其mRNA水平(copies/μl)分别为35150±1.1、4578±1.1、2795±1.2、403±1.9、45±2.1、2.87±1.1、1.53±1.0.较对照组差异也具有统计学意义(P<0.01);1、2、3、4、6 Gy剂量下,照射加药组较单纯照射组差异具有统计学意义(P<0.05);而8、10 Gy剂量下,该差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】在低照射剂量下,拓扑替康可能通过降低CNE-I细胞中TOPO-I基因表达水平来达到放射增敏作用。 展开更多
关键词 拓扑替康 放射增敏 荧光定量RT—PCR 拓扑异构酶Ⅰ
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胃癌及其转移淋巴结组织中胰岛素样生长因子-I的表达及其临床意义
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作者 李鹏胜 彭俊生 肖方联 《实用癌症杂志》 2006年第6期579-581,共3页
目的探讨IGF-I在胃癌发生发展中的作用及其临床意义。方法应用荧光定量RT-PCR法,检测40例胃癌及其转移淋巴结组织中的IGF-I表达情况,以40例消化道溃疡胃组织标本作对照,将其表达结果和患者临床病理指标进行综合分析。结果胃癌中IGF-I的... 目的探讨IGF-I在胃癌发生发展中的作用及其临床意义。方法应用荧光定量RT-PCR法,检测40例胃癌及其转移淋巴结组织中的IGF-I表达情况,以40例消化道溃疡胃组织标本作对照,将其表达结果和患者临床病理指标进行综合分析。结果胃癌中IGF-I的表达[(9.24±3.16)×104拷贝/μgRNA]明显高于正常胃黏膜组织[(2.09±1.05)×103拷贝/μgRNA](P<0.05);TNM分期中Ⅰ+Ⅱ期IGF-I表达[(7.35±1.24)×104拷贝/μgRNA]低于Ⅲ+Ⅳ期[(1.05±3.44)×105拷贝/μgRNA](P<0.05);癌转移淋巴结组织IGF-I表达[(1.03±0.36)×105拷贝/μgRNA]明显高于无癌转移淋巴结[(7.62±1.17)×104拷贝/μgRNA](P<0.05)。结论IGF-I在胃癌组织中的高表达可能与胃癌的发生、发展有关;癌转移淋巴结组织中IGF-I表达量明显增高,提示IGF-I有可能参与了胃癌的侵袭和转移。 展开更多
关键词 胃癌 胰岛素样生长因子-Ⅰ 荧光定量RT—PCR
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